现代科技综述知识文库：流式细胞仪.pdf

现代科技综述系列—— 流流式式细细胞胞仪仪 科技是人类区别于动物的重要文明之一， 是人类对自然规律研究 利用的学科。 本文提供对科技基本概念 “流式细胞仪” 的解读，以供大家了解。 流流式式细细胞胞仪仪 又称荧光激活细胞分类仪(FACS)或流式细胞术(FCM) 。 它是当代激光、电子学、流体力学、光学精密机械、 计算机、荧光染料、细胞生物学、分子免疫学等学科 技术高度发展的产物，具有很强的数据采集及分析、 分选功能。 特别是在细胞分类、分析细胞表面标志、核酸含量等 方面，有其独特作用，是近代生物学、医学领域中最 先进的仪器之一。 1964年，库尔特(W ．Coulter)等介绍了FCM 的应用技 术。 但此后的10多年间没有受到应有的重视。 80年代以后，FCM得到快速发展 广泛应用。 尤其是近年来激光、光学精密仪器、计算机等学科技 术的高度发展，使FCM 的性能不断完善，从而可以快 速进行细胞分类，定量地测定核酸含量、酶活性、细 胞体积、细胞膜表面受体 抗原等成分，在细胞生物 学、细胞生理病理学、细胞遗传学、免疫学、血液 学、药物学、海洋生物学、植物学等方面有着广泛应 用。 FCM 由样品处理 输出系统、检测系统、电子计算机 数据分析系统3个集成部分组成。 其工作原理并不复杂，通过流体力学的作用，让样品 中的细胞排成单行，以稳定的速度同方向通过检测 区。 在检测区内，预先经过特定荧光素染色或细胞化学处 理的细胞，在聚焦激光束照射下，产生荧光 散射光 信号。 信号的强弱与细胞内各种组分如核酸 蛋白质等的含 量成正比，通过测定荧光信号的强度，即可知道细胞 内各组分的含量。 不同物质具有不同荧光光谱，如经吖啶橙染色的细 胞，其RNA发红色荧光，DNA发绿色荧光，这样仪器 就可以同时测定RNA DNA 。 细胞的散射光信号是由细胞的衍射、折射光 反射光 组成的，它取决于细胞的大小、形状、密度 染料的 吸收等。 用光电倍增管测定细胞的90°散射光，以获得细胞表面 结构等方面的信息；用光电探测器检测细胞的小角(如 0 ．5°～2°)散射光，用于测定细胞的大小等。 把各光电探测器检测到的荧光信号 散射光信号转换 成电脉冲，送到信号处理单元，脉冲高压取决于接受 光的大小。 综合电脉冲的高低、宽度、面积，用计算机综合分析 出细胞的大小、表面标记、内部结构，从而对每次测 到的细胞作出准确评价，并以单参数直方图、双参数 直方图或三维图的方式表示，实时显示出来。 也可以把结果存盘或打印出来。 FCM 的精确度可通过荧光微球的变异系数( FCV)来反 映。 通常，分析免疫荧光时，要求对数绿色荧光(LGFL) 的 FCV ＜5% ，前向散射光(FLS) 的 FCV ＜3% ；分析核 酸(DNA或RNA)含量时，要求红色荧光(RFL) 的 FCV 至少＜1．5% 。 因此，每天开机时，应根据分析内容核查荧光微球的 FCV是否在允许值之下，若高出允许值，应校正仪器 的精密度。 FCM分选细胞的速度及纯度是目前任何其他医学仪器 无法比拟的。 其分选速度可高达3000～5000个细胞／s，纯度可高达 99% 以上。 在流动室上安装一个超声振荡器，从喷嘴往下喷射的 液流在该振荡器的作用下被打断成一个接一个的液 滴，细胞也被分散在这些小液滴中。 通过光电检测器测定细胞的各种信号，如果信号满足 预定的条件，即对应于所要收集的细胞，电子线路就 产生一个电脉冲。 该电脉冲在液流快要形成液滴时，通过电极对细胞充 电，此时含有细胞的液滴就带有电荷。 根据不同的要求，可对液滴分别