过表达及敲除细胞系建立及所需材料详细.pptVIP

的片段DNA以及载体质粒，使两者暴露黏性末端，为下一步连接做准备。酶切完全后（一般至少3小时，最好过夜），同样利用凝胶电泳观察条带是否被完全切开，载体跑胶时需加一道未切割的载体做对照以确定是否被酶切完全（质粒为闭合环状、开环或是线性时跑出来条带的大小各不相同，且容易区分），之后选择正确的位置，切胶，胶回收。 （3）连接—利用T4连接酶将酶切好的载体与目的片段进行连接，室温3小时。 （4）转化—将连接好的体系利用热激原理转入细菌感受态中，并通过37度摇床小摇45min活化感受态，最后铺板， 37度过夜（12-14小时）。 （5）小摇—挑取单克隆至3ml带抗性的LB中，37度摇床小摇8-12小时。 （6）PCR验证—利用之前扩增时的相同引物对小摇的菌液sample进行PCR验证，同时带上模板菌液或是质粒作为阳性对照，并跑胶观察条带进行鉴定。 （7）测序—选取3-5个PCR阳性样品送测序公司进行测序，先测正向反应，等待结果反馈对比后选取正向完全正确及图谱峰值稳定的sample再进行反向测序，最后选取测序比对完全正确的sample（存在无意义点突变的sample也可选择）。 （8）扩增—大摇、大抽：取正确的sample菌液至100-150ml的含抗LB中， 37度摇床大摇12-14小时，收集菌液利用大抽试剂盒进行大抽（约需要4-6小时） （9）跑胶验证条带并利用Nanojob进行核酸定量。