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青霉素发酵 陈祥 200920142261 罗刚 200920142281 1 一 ﹑ 青霉素的发现 ? 发现青霉素的是英国细菌学家亚历山大 · 弗莱明。 1928 年，弗莱明在检查培养 皿时发现，在培养皿中的葡萄球菌由于被污染而长了一大团霉，而且霉团周围 的葡萄球菌被杀死了，只有在离霉团较远的地方才有葡萄球菌生长。他把这种 霉团接种到无菌的琼脂培养基和肉汤培养基上，结果发现在肉汤里，这种霉菌 生长很快，形成一个又一个白中透绿和暗绿色的霉团。通过鉴定，弗莱明知道 了这种霉菌属于青霉菌的一种，于是，他把经过过滤所得的含有这种霉菌分泌 物的液体叫做“青霉素”。接着弗莱明又把这种霉菌接种到各种细菌的培养皿 中，发现葡萄球菌、链球菌和白喉杆菌等都能被它抑制 。 ? 1929 年，弗莱明发表论文报告了他的发现。但是青毒素的提纯问题还没有得 到解决，这使这种药物在大量生产上遇到了困难 。 ? 1935 年，英国病理学家弗洛里和侨居英国的德国生物化学家钱恩合作，重新 研究青霉素的性质、分离和化学结构，终于解决了青霉素的浓缩问题。当时正 值二战期间，青霉素的研制和生产转移到了美国。青霉素的大量生产，拯救了 千百万伤病员，成为第二次世界大战中与原子弹、雷达并列的三大发明之一。 2 二、菌种介绍 最初青霉素的生产菌是音符型青霉菌，生产能力只有几十个单位， 不能满足工业需要。随后找到了适合于深层培养的橄榄型青霉菌， 即产黄青霉（ P. chrosogenum ），生产能力为 100U/ml 。经 过 X 、紫外线诱变，生产能力达到 1000 － 1500U/ml 。随后经 过诱变，得到不产生色素的变种，目前生产能力可达 66000 － 70000U/ml 。 3 三、发酵工艺过程 生产孢子的制备：将砂土保藏的孢子用甘油、 葡萄糖、蛋白胨组成的培养基进行斜面培养， 经传代活化。最适生长温度在 25~26 ℃ ，培 养 6~8 天，得单菌落，再传斜面，培养 7 天， 得斜面孢子。 移植到优质小米或大米固体培养基上，生长 7 天， 25 ℃ ，制得小米孢子。 每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及 杂菌情况。 4 三、发酵工艺过程 种子罐和发酵罐培养工艺种子培养要求产生大量健壮的菌丝体， 因此，培养基应加入比较丰富的易利用的碳源和有机氮源。青霉 素采用三级发酵 一级种子发酵：发芽罐 . 小罐，接入小米孢子后，孢子萌发，形成 菌丝。培养基成分：葡萄糖，蔗糖，乳糖，玉米浆，碳酸钙，玉 米油，消沫剂等。通无菌空气，充分搅拌 300 － 350r/min ； 40~50 小时； pH 自然，温度 27 ± 1 ℃ 。 二级发酵罐：繁殖罐 . 大量繁殖。玉米浆、葡萄糖等。 250 － 280r/min ； pH 自然， 25 ± 1 ℃ ； 0 － 14h 。 三级发酵罐：生产罐。花生饼粉（高温），麸质粉、玉米浆、葡 萄糖，尿素，硫酸铵，硫酸钠、硫代硫酸钠，磷酸二氢钠，苯乙 酰胺及消泡剂， CaCO3 等。接种量为 12~15% 。青霉素的发酵 对溶氧要求极高，通气量偏大； 150 － 200r/min ；要求高功率 搅拌， 100 m3 的发酵罐搅拌功率在 200~300 Kw ，罐压控制 0.04~0.05 MPa ，于 25~26 ℃ 下培养，发酵周期在 200h 左右。 前 60h ， pH5.7~6.3 ，后 6.3~6.6 ；前 60h 为 26 ℃ ，以后 24 ℃ 。 5 四、发酵过程控制 6 四、发酵过程控制 加糖 补氮 溶氧 ph 泡沫 7 ? 碳源：产黄青霉菌可利用的碳源有乳糖、蔗糖、葡萄糖等。 目前生产上普遍采用的是葡萄糖母液和工业用葡萄糖进行流 加。 ? 氮源：生产上常选用花生饼粉、玉米胚芽粉、麸皮及尿素。 ? 前体：可用苯乙酸、苯乙酰胺，一次加入量不大于 0.1% ，并 采用多次加入，以防止前体对青霉素的毒害。 ? 无机盐：加人的无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等，用量要 适度。另外，由于铁离子对青霉菌有毒害作用，必须严格控 制铁离子的浓度，一般控制在30μg/ml。 培养基成分控制 8 培养条件控制 加糖控制 ? 加糖量的控制是根据残糖量及发酵过程中的 pH 值确定，一般在残糖降至 0.6% 左右， pH 值上升 时开始加糖。 9 补氮及加前体 ? 补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素，使发酵液氨 氮控制在 O.01%-0.05% ? 补前体以使发酵液中残存苯乙酰胺浓度为 0.05%-0.08% 10 温度 ? 25℃左右 ? 对菌丝生长和青霉素合成来说，最适温度不是 一样的，一般前者略高于后者，故有的发酵过 程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生 长时间，到达生产阶段后便适当降低温度，以 利于青霉素的合成。 ? 前期 25- 26℃，