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实 验 一 - - CTAB 法 提 取 植 物 基 因 组 DNA 精品文档 实验一 CTAB 法提取植物基因组 DNA 实验目的： 学习从植物组织中（幼叶）提取基因组 DNA 的基本原理和方法。 实验原理： 采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种 酶类（尤其是氧化酶类），其对 DNA 的抽提产生不利的影响，所以在抽提缓冲 液中需加入抗氧化剂或强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。在液 氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵 ) ，是一 种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐的溶液中（ 0.7mol/L NaCl ）是可溶的，通过有机溶剂抽 提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀（ CTAB 能溶于乙醇）即可 使核酸分离出来。 CTAB 溶液在低于 15度时会形成沉淀洗出，因此再将其加入冰冷的植物材 料中之前必须预热（ 65度），且离心温度不要低于 15度。 实验步骤： 1、取幼嫩的植物叶片（ 3-5g）剪碎液氮研磨成粉，转入 1.5ml离心管内。 加入等体积的 65℃预热的 DNA 提取缓冲液置于 65℃的恒温水浴摇床上 1- 2h(1.5h) 。 2、加入等体积的氯仿：异戊醇 (24：1)，轻轻上下颠倒 5分钟，静置 5分 钟，之后于 12000rpm离心 10分钟。 3、吸取上层水相，重复步骤 2一次。 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除 精品文档 4 、吸取上层水相，加入预冷 2/3体积的异丙醇，轻缓颠倒 2分钟并置 -20℃冰 箱内 10min，待 DNA 沉淀后于 12000rpm离心收集，收集的 DNA 于70%乙醇中洗 2-3次。将弃去乙醇风干后的 DNA 加适量水使其溶解。 5、待DNA 完全溶解后加入 1-2 μl不含 RNAaseA （10mg/ml），37℃保温 1h以 除去 DNA 中的RNA 。 6、于Eppendorf管中加入 1mL氯仿：异戊醇（ 24：1）轻轻上下颠倒 10分钟 后 10000rpm离心 10分钟。 7、吸取上层水相并先后加入 1/10体积的 3M醋酸钠及 2倍总体积的预冷的无 水乙醇，接着置于 -20℃冰箱， 10分钟后 10000rpm离心 10分钟，弃去无水乙醇， 加入 70％乙醇洗涤 2-3次，风干，最后将 DNA 溶于适量（ 200-500 μl） TE 中。 8、待DNA 完全溶解后进行 1%琼脂糖凝胶电泳，检查 DNA 的质量并据已知 的DNA 分子量标准估计其浓度。调整浓度后的 DNA 置于 -20℃备用。 实验试剂： 1、1M Tris-HCL （pH8.0） 121.1g Tris溶于 800ml无菌水中，加浓 HCL 调pH到8.0，定容至 1L，高压灭 菌。 2、0.5M EDTA （pH8.0） 186.1g EDTA-Na 2H·2O溶于800ml 无菌水中，需用磁力搅拌器剧烈搅动，用 NaOH调pH值到8.0 （约20g），定容至 1L，高压灭菌。 3、3.5M NaCL 204.75g NaCL溶于 1L无菌水中，高压灭菌。 4 、10% CTAB 溶液