融合蛋白柔性linker的选择.pdfVIP

蛋白融合 Linker 的设计与选择 接头序列(Linker)设计是基因融合技术能否成功的关键技术之一。 即通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来, 使其在 适当的生物体内表达成为一条单一的肽链, 其中起连接作用的氨基 酸称为Linker[1]。融合蛋白中的两种成分能否分别形成正确的空间结 构、 更好的发挥生物学活性, 与连接融合蛋白中两种成分的接头序 列密切相关。重组生成的融合蛋白要求插入融合蛋白中的 linker 不能 影响目的蛋白各自的功能。因此, Linker 序列的设计和选择对融合基 因的构建至关重要。 针对Linker 序列的设计和选择己有诸多相关的研究[2]。目前的 研究主要有两种, 即螺旋形式的 Linker 肽如[A(EAAAK)nA]和低疏水 性、 低 电荷效应的氨基酸组成的接头, 以后者应用较广泛。这种低疏 水性、 低 电荷效应的氨基酸组成的多肽接头能够充分伸展以分开两 种融合的组分, 使之能在互不干扰的情况下充分折叠成各自的天然 构象。Ryoichi 等[3]在两种不同功能的融合蛋白之间插入了不同类型 的 linker 序列, 包括可形成螺旋状的不同 度的肽链、 柔性 linker 以 及葡萄糖球菌蛋白 A(PA) 。结果发现螺旋状的 linker 同柔性 linker 及 PA 一样, 可以有效的将融合蛋白的两个结构域分开, 甚至可增强融 合蛋白的功能。Linker 的 度是融合基因构建的又一个重要的因素。 如果 Linker 的 度过 , 则使融合蛋白对蛋白酶比较敏感, 导致活 性融合蛋白在生产过程中的产量下降; 应用较短的 Linker, 可以克服 重组蛋白酶分解的问题, 但可使两个融合分子相距太近导致蛋白功 能的丧失。Linker 的 度不应小于 3.5 nm , 这是由于相邻肽键的距离 为 0.38 nm, 因此连接肽至少应包含 10 个氨基酸。目前最为常用的是 Huston 设计合成的(GGGGS)3 序列。研究发现, 连接肽为(Gly4Ser)3 的 融合蛋白表现出较高的复性效率。这可能是(Gly4Ser)3 连接肽较 且 柔软, 在复性时能够降低融合蛋白的两组份间的空间位阻, 从而更有 利于融合蛋白各个结构域的正确折叠。所以, Linker 的 度不能过 也不能过短。 Linker 的选择, 还应考虑 Linker 内部的氨基酸序列, 研究发现, Linker 组成相同但序列不同时, 构建的融合蛋白的稳定性存在显著差 异; 编码 Linker 的核苷酸组成, 调整编码 Linker 的核苷酸组成, 虽不 改变原接头 Linker 的氨基酸序列, 但融合蛋白的表达存在显著差异。 Linker 序列中有太多的 α 螺旋和 β 角结构会限制融合蛋白的伸缩性, 进而影响融合蛋白的生物学活性。总之, Linker 的选择不是一成不变 的, 而要根据融合蛋白分子的大小和特性来决定。 细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、 分泌 的一大类多功能、 高活性的生物物质。它在介导机体多种免疫反应 及对各类免疫活性细胞的分化、 发育和活化中起着十分重要的作用。 细胞因子融合蛋白(cytokine fusion protein)技术是当今免疫学研究的 一个热点方向。该方法是基于这些细胞因子具有相同或相关的功能活 性而各自作用靶点不同, 利用基因工程技术将两种或多种细胞因子 融合在一起, 其融合基因表达产物既具有其组成因子独特的生物学 活性或使其某些活性显著提高, 还