2019精选医学实验三伪狂犬病抗体检测.pptVIP

实验四、伪狂犬病抗体检测 （ 阻断 ELISA) 酶联免疫吸附试验 ( Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) 将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯 乙烯微量反应板 ) 表面，从而使酶标记的抗原抗 体反应在固相表面进行，根据加入底物的颜色 反应来判定是否有免疫反应的存在。 一、实验目的 1. 了解 ELISA 的原理和类型 2. 掌握阻断 ELISA 操作程序 二、实验原理 1. 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面， 并保持其免疫学活性； 2. 抗原或抗体可通过共价键与酶形成酶结合物，而 此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； 3. 酶结合物催化底物发生化学反应，根据颜色的有 无和深浅判定抗原抗体反应的发生与否。 ? 间接法（ Indirect ELISA ） ? 阻断法（ Block ELISA) ? 双抗体夹心法（ Sandwich ELISA) ? 竞争法（ Competitive ELISA) （ 1 ）间接法测定抗体 A. 将 抗原 吸附于固相载体表面； B. 加抗体 , 形成抗原 - 抗体复合物 ; C. 加酶标抗体； D. 加底物。测定底物的降解量＝抗体量。 显色 间接 ELISA （ 2 ）阻断法测定抗体 A. 将 抗原 吸附在固相载体表面 ; B. 先加待检血清（抗体） , 形成抗原 - 抗体复合物 ; C. 再加酶标单抗； D. 加底物。 单抗 血清 ？ 底物显色 阻断 ELISA （ 3 ）双抗体夹心法测定抗原 A. 将 抗体 吸附于固相表面 ; B. 加待检抗原，形成抗原 - 抗体复合物 ; C. 加酶标抗体 ; E. 加底物。底物的降解量＝抗原量。 （ 4 ）竞争法测定抗原 A. 抗体 吸附在固相载体表面 ; B. 同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知 抗原量。 1. 酶标板，酶标仪 2. 包被缓冲液： 0.025M pH9.6 碳酸盐缓冲液 3. 猪伪狂犬病毒（ PRV ） —— 抗原 4. 样品稀释液： pH7.4 PBS 三、实验材料 4. 阴性对照（ EP 管中，已稀释） 5. 阳性对照（ EP 管中，已稀释） 6. 样品 —— 待测猪血清（ EP 管中，已稀释） 7. AP 标记猪 PRV 单抗—— 酶标单抗（ EP 管中，已 稀释） 8. 洗涤液：含 0.05% Tween 20 的 0.01M pH7.4 PBS （青瓶） 常用酶及底物 常用酶 底物 反应后颜色 辣根过氧化物酶 （ HRP ） 邻苯二胺（ OPD ） 棕黄色 碱性磷酸酶 （ AP ） 四甲基联苯胺 （ TMB ） 蓝色 9. 底物缓冲液： pH5.0 磷酸盐柠檬酸缓冲液 10. 底物溶液： TMB （四甲基联苯胺），底物缓冲液， 30% H 2 O 2 ， 新鲜配制 11. 终止液 1. 抗原处理： 2. 抗原包被： 取酶标板，加入100μL/孔的抗原稀释液 4℃， 18h 取出包被好抗原的酶标板（ 4 孔 / 组），甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤 3 次， 3min/ 次 四、实验方法 3. 加待测血清： 标记各孔，加入相应液体100μL/孔 1 2 3 4 阴 性 待 测 阳 性 待 测 4. 加单抗： 37℃， 30min 甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤 3 次， 3min/ 次 各孔加入酶标单抗100μL/孔 37℃， 30min 5. 显色： 甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤 3 次， 3min/ 次 加入底物溶液100μL/孔 避光显色， 10min, 加终止液 1 滴 6. 观察结果