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第五章 蛋白质结构解析 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析 一、核磁概述 ? 瑞士科学家发明了“利用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三 维结构法”。 ? 这种方法的优点是可对溶液中的蛋白质进行分析。原理可以用测 绘房屋的结构来比喻，首先选定一座房屋的所有拐角作为测量对 象 , 然后测量所有相邻拐角间的距离和方位 , 据此就可以推知房屋 的结构。 ? 维特里希选择生物大分子中的质子 ( 氢原子核 ) 作为测量对象 , 连 续测定所有相邻的 2 个质子之间的距离和方位 , 这些数据经计算机 处理后就可形成生物大分子的三维结构图。 1 、 NMR 基本原理 ? 核磁共振是一种吸收光谱， ? 在外磁场的作用下，核自旋能级发生分裂，当 用无线电波范围的电磁辐射照射样品时，不同 结构中的原子核吸收适当频率电磁辐射，发生 核能跃迁，产生共振信号，记录信号的位置和 强度就得到 NMR 波谱。 NMR 的基本原理 ? 原子核的自旋运动 原子核具有一定的质量和一定的体积， 可以把它看成是一个接近球形的固体。实验表明，大多数 的原子核如同陀螺一样，都围绕着某个轴作自旋运动。例 如，常见的 H 1 和 C 13 核等都具有这种运动。 无自旋运动的 有自旋运动的核 陀螺的自旋运动 2 、核磁共振中几个常用的参数 ? 化学位移： 把由于原子和分子中核的化学环境不等价而引 起拉摩尔进动频率的变化叫做化学位移。 ? 自旋自旋偶合： 由于分子内部原子核的磁相互作用引起的 通过电子壳层传递的，使分子中的核在电子壳层中感应出 一个磁矩，然后再作用到被侧核上，从而改变了被侧核的 共振条件，使谱线分裂为多重线。这种谱线的精细结构也 称为自旋 — 自旋分裂。 ? 驰豫时间： 核自旋系统由于受到外界作用离开平衡状态后， 能够自动地向平衡状态恢复，即从高能级恢复到基态的过 程称为弛豫过程。弛豫现象是由于物质相互作用而发生的， 弛豫时间是描述这种相互作用的参数。 核磁共振波谱仪原理 ? 两个磁铁产生均匀、稳定的静磁场 Ho ，两磁极间放样品管，并有一 机械旋转装置，可使样品管在两极间旋转。样品管外面是射频振荡线 圈，它被安装在与外磁场 Ho 垂直的方向，可发射固定频率的无线电 波。该磁场的有效部分是一个强度为 H 1 绕着 H 0 旋转的磁场，当射频 频率等于核的进动频率（ω=γH 0 ）时，发生共振。把得到的信号送 到射频接收器，经射频放大器放大，通过相位调节，得到所需要的纯 吸收型或色散型信号，并由记录器给出谱图。 射频发生器 射频接收器 线圈 记录仪 扫描发生器 生物 NMR 常用实验技术 ? 同核相关谱 （ COSY ）用来鉴定具有偶合关系的质子对。其形态为矩形图 谱中间分布着一些同心圆，实际上是一些吸收峰的等高线截面图，称为交 叉或相关峰，表示相应质子间存在着偶合关系。 ? 双量子滤波相关谱 （ DQF-COSY ）一般采用所谓时间相位比例增量法 (TPPI) 记录谱图，即所谓的相敏 COSY 谱。其每一个交叉峰都由若干个正 负相间的信号组成，其所构成的精细结构包含有质子间复杂的偶合关系和 偶合常数等进一步的信息。 ? 全相关谱 (TOCSY) 又称 HOHAHA 谱，在它的脉冲序列中包含有自旋锁 定的步骤，能将一个自旋体系的全部自旋相关联。 ? NOE 相关谱 （ NOESY ）用于鉴定质子在空间的相互接近。空间相互接近 的质子之间，会产生交叉驰豫的现象，即 NOE 效应。 ? ROESY 谱 是在一种旋转坐标下测定的 NOESY 谱 。 NMR 测定蛋白质三维结构的基本过程 蛋 白 质 三 维 结 构 NMR 波 谱 分 析 适用范围 —— 分子量 ? 分子量受限：谱峰重叠，分子增大造成横向弛豫 时间减少（线宽增加） ? 同核二维 1 H 谱： 80 氨基酸 ? 异核多维（二维、三维）： – 常规三共振（ 1 H, 15 N, 13 C ） 200 氨基酸 – 氘标记，特殊标记 已报道有 700 氨基酸 ? 同核样品可以是天然提取、化学合成或分子生物 学方法培养制备 ? 标记样品通常只能通过分子生物学方法培养制备 常规样品 ? 浓度：毫摩尔每升 – 500uL 10kDa ? 5 毫克每样品 ? 均一 ? 没有聚合 ? 水溶液（ 10% 重水锁场） pH7.5 – 常用缓冲体系： Tris-HCl, 磷酸盐，醋酸盐 ? 稳定性：室温下大于一周 – NaN 3 – 蛋白酶抑制剂