琼脂糖凝胶的配制和DNA回收.docVIP

配1%的琼脂糖凝胶 称量琼脂糖0.3g，倒入锥形瓶中，再用量筒量取30ml TAE，混到一起，放入微波炉中煮沸两次，直到看不到颗粒为止（每次大约三分钟），取出后冷却至60℃左右后加入Gold view（万分之一），同时将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。吸取少量琼脂糖溶液封固胶膜边缘，任其凝固，在距离底板0.5～1.0mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔，将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。凝胶的厚度在3～5mm之间，检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。冷却好后拔梳子（30min左右），将板放入电泳槽里，倒入TAE溶液（1X），在冰箱中拿Loading buffer和两个maker（1kb和D100），将Loading buffer吸到PE手套上（吸取量随意用枪点一下即可）和样品混匀，向凝胶中加样，两侧的孔里加Maker，通电120V跑胶，红为正，黑为负（DNA带负电，所以往红色正极处跑），放到紫外盒上看结果，同时将亮带部分切下来放入1.5ml的已经称完重量的EP管中（若忘了称重量，按照0.9计算），再次称重计算胶的重量，接下来按照DNA回收试剂盒操作步骤回收DNA，测浓度。 普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒操作步骤 使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 1. 柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl平衡液BL，12,000 rpm(~13,400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子） 2. 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。 3. 向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1 g，其体积可视为100 μl，则加入100 μlPN溶液），50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。 注意：对于回收300 bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。 4. 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 注意：吸附柱容积为800 μl，若样品体积大于800 μl可分批加入。 5. 向吸附柱CA2中加入600 μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm(~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW加入后静置2-5 min再离心。 6. 重复操作步骤5。 7. 将吸附柱CA2放回收集管中，12,000 rpm (~13,400×g )离心2 min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。 注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。 8. 将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2 min。12,000 rpm (~13,400×g )离心2 min收集DNA溶液。 注意：洗脱体积不应小于30 μl，体积过少影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。DNA也可以用缓冲液(10 mM Tris-Cl, pH8.0) 洗脱。为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g)离心2 min，将DNA溶液收集到离心管中。 DNA浓度及纯度检测 回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。 DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50 μg/ml双链DNA、40 μg/ml单链DNA。 OD260/OD280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用ddH2O，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。