流式细胞项目临床推广2012.ppt

流 式 细 胞 术 的 临 床 应 用 肖莹 2012.03.16 主要内容 流式细胞术概念 流式细胞术特点 流式细胞术原理 流式细胞仪的临床应用 流式试剂简介 流式细胞术概念 流式细胞技术（ Flow Cytometry，简称FCM） 是利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或其他各种微粒进行的多参数、快速的分析和分选的技术。 流式细胞仪（Flow Cytometer）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。 流式细胞术的特点 极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。 可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。 定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。 强大的分选功能，在分析的同时可以对特定群体加以分选。 流式细胞术可检测的样本 可检测的样本种类多样： 各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等 血清、血浆、培养上清、细胞裂解液 样本制备： 单细胞悬液（天然，机械研磨/消化） 5×105－1×107cells/ml，约0.5 － 1ml，300目筛网过滤 流式细胞仪的检测范围 细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 流式细胞仪的结构 液路——流动室及液流驱动系统 光路： 1、光源 2、光学系统：透镜、滤光片 电子系统：光电转换器件（光电二极管，光电倍增管PMT）、信号处理电路 计算机系统：存储、显示、分析 液路：鞘流系统 流式细胞仪的检测信号 散射光信号： 前向角散射光（FS，Forward Scatter) 侧向角散射光（SS，Side Scatter） 荧光信号： FL１、FL2、FL3、FL4…… 散射光信号 新鲜外周血的流式检测图（溶红后） 荧光信号 荧光信号 工作原理 流式抗体的选择搭配及对照的设定 抗体(Antibody) 荧光染色对照的设置 同型对照 同型对照（Isotype Control）：与染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型称为免疫球蛋白同型对照。 同型对照的选择原则 与染色的单克隆抗体 ①相同种属来源 ②相同免疫球蛋白及亚型 ③相同荧光素标记 ④相同剂量和浓度 例如，标记FITC的单克隆抗体为小鼠IgG1 亚类抗体，标记PE的单克隆抗体为小鼠 IgG2a亚类抗体，同型对照应选用相同浓 度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化IgG1 (γ1) -FITC和IgG2a( γ2a)- PE 补偿对照 荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectral overlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。 将单种荧光素标记的单克隆抗体分别进行单色荧光染色 ※几色分析就需要制备几个补偿对照管 各种对照的设立 流式细胞仪的应用 流式细胞仪的应用领域 临床研究: 血液、肿瘤、药理、免疫…. 生物学研究： 遗传、生殖、微生物、细胞生物、毒理、分子生物…. 环境研究： 海洋生态研究…. 制药工业 食品工业 农业畜牧业 流式细胞仪的临床应用(免疫) 淋巴细胞免疫分型 淋巴细胞亚群分析 CD4绝对计数 HIV的诊断与研究 淋巴细胞 CD4/CD8分析 CD4绝对计数 T细胞活化 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 免疫功能和免疫调控的研究 淋巴细胞和单核细胞的活化检测 细胞因子的检测 HLA-B27检测 流式细胞仪的临床应用(血液) 白血病和淋巴瘤免疫分型 残留白血病 造血干细胞计数 PNH诊断 网织红细胞分析 血小板分析 血小板膜糖蛋白分子的表达 血小板活化 网织血小板分析 流式细胞仪的临床应用(肿瘤) 细胞周期分析 DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 在LL病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待 形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能 DN