野外采样实验.pdfVIP

野外取样实验方案（201604 ） 1. 实验目的 研究自然条件下东南景天不同生育期间，其内生菌多样性的 动态变化。 2. 实验设计 选择在东南景天的苗期、开花期、成熟期，于浙江衢州铅锌矿山 采集具有代表性 5 个样点的超累积生态型东南景天，混合为一个样品 并将其连同根际土壤放入无菌的塑料箱中，地上部裸露于袋外，保持 鲜活状态，带回实验室，然后进行后续处理。 3. 实验内容 （1）powersoil 试剂盒提取根际土壤菌 DNA （2） 可培养植物内生菌分离 （3） CTAB 法提取植物内生菌 DNA （4） 植物重金属含量测定 （5） 土壤理化性质测定 实验一 powersoil 试剂盒提取根际土壤菌 DNA 1. 实验目的 powersoil 试剂盒提取根际土壤菌 DNA，保存，待之后送检 2. 实验步骤 （1） 获取东南景天根际土壤 小心把东南景天从土壤中取出，用镊子夹取粘附在根表的土壤。 每个样点夹取约 3g 土壤，取 1g 立即提取 DNA，余下装入封口袋， （？） -20℃保存。 （取出的东南景天表面洗净，晾干。测量鲜重后，杀青，烘干。测 量干重后，研磨，待测。植物重金属含量，3 个重复，每个重复 0.1g，共 需要植物根茎叶鲜重各 5g） （ 2） 选 取 Mobio PowerSoil DNA Isolation Kit （ MO BIO Laboratories, Inc, Carlsbad, CA）试剂盒提取土壤样品 DNA。具体操作 步骤如下： 1）称取约 0.25g 土壤样品，放入研磨珠套管（PowerBead Tubes）， 涡旋混匀。 2）套管中加入 60μl C1 溶液（裂解缓冲液），颠倒数次，涡旋 5s 混 匀。 3）将套管放入水平涡旋振荡仪，在最大速度振荡 10min。 4）取出套管，在室温下 10000×g 离心 30s。 5）把上清液（约 400~500μl）转移到新的 2mL 离心管。 6）加 250μl C2 溶液（抑制物去除液）至离心管中，涡旋 5s，4℃下 放置 5min，在室温下 10000×g 离心 1min。 7）将上清液转移到另一新的 2mL 离心管，总体积不超过 600μl， 同时避免吸出沉淀物。 8）加 200μl C3 溶液（抑制物去除液）至离心管中，涡旋混匀，4℃下 放置 5min，在室温下 10000×g 离心 1min。 9）将上清液转移到另一新的 2mL 离心管，总体积不超过 750μl， 同时避免吸出沉淀物。 10）加 1.2mL C4 溶液（高盐溶液）至离心管中，涡旋混匀，从离心 管中抽取约 650μl 溶液至离心过滤管（Spin Filter）。 11）在室温下 10000×g 离心 1min，取出管中过滤柱，弃去液体，过 滤柱放回管中。 12）加入第 10 步离心管中约 650μl 溶液，重复第⑾步操作，加入 第 10 步离心管中剩余的溶液，重复第 11 步操作。 13）加 500μl C5 溶液（乙醇淋洗缓冲液）至离心过滤管中，在室温 下 10000×g 离心 30s，弃去管中液体。 14）在室温下 10000×g 离心 1min。 15）取出过滤柱小心放入新的 2mL 离心管中，避免任何 C5 溶液 溅到过滤柱上。 16）加入 60μl C6 溶液（DNA 洗脱液）或无菌超纯水至过滤柱白色 薄膜中，在室温下 10000×g 离心 30s。 17）弃去离心柱，提取完成。分装-20℃保存，待下一步应用。 实验二 可培养内生细菌的分离纯化保存 1. 实验目的 （1）分离东南景天内生菌，记录菌落数，菌落种类数，菌落形态，优 势菌菌落数。 （2）菌落纯化，保存菌种。 2. 仪器和试剂 2.1 内生菌分离 （1）需要干热灭菌的仪器