质粒DNA的提取及定性定量分析(汇编).pdfVIP

精品文档 质粒 DNA 的提取及定性定量分析 实验目的 ：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术与方法 实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 之间，拓扑学 上的差异而达到分离目的。在 PH介于 12.0~12,5这个狭窄的范围内，线性的 DNA双 螺旋结构解开而变性，而共价闭合环状质粒 DNA 的氢键会断裂，但两条互补链彼此 相互缠绕，仍会紧密结合在一起，当加入 PH4.8 的乙酸甲高盐缓冲液恢复 PH 至中性 时，共价闭合的环状质粒 DNA 的复性迅速而准确，而线性染色体的 DNA 因两条互补 链已完全分开，复性就没这么迅速准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体 DNA与大分子的 RNA、蛋白质— SDS复合物等一起，沉淀下来而被除去。 实验器材及用品： 小指管、 台式离心机、 漩涡振荡器、 大肠杆菌， 冰、溶液 I、溶液 II、溶液 III.、 酚：氯仿：异戊醇、氯仿：异戊醇、无水乙醇、 70%乙醇、TE缓冲液 等 实验内容： 1、将过夜培养的大肠杆菌菌液加入 1.5ml 小指管中， 4000r ／min 1min， 吸去培 养液，将所有菌体细胞收集到一个小指管中。 2 、加入 100 微升溶液 I 于含菌体细胞的小指管中，漩涡震荡将细胞沉淀悬浮， 室温 放置 10min. 3 、加入 200 微升溶液 II （新鲜配制），轻轻混匀内容物， 1min 之内加入 150 微升溶 液 III （冰上预冷），盖紧管口，轻轻混匀数次，冰上放置 15min 让质粒 DNA 复性（千 万不可以用漩涡振荡器） 。 4、12000r ／min 离心 10min，将上清液转至令一 1.5ml 小指管中。 5 、向上清中加入等体积酚： 氯仿：异戊醇 （25:24:1 去蛋白质和脂质） ，漩涡 混匀后， 冰上放置 10min，12000r ／min 离心 10min ，将上清液转至令一 1.5ml 小指管中。 6 、向上清液加入 2 倍体积无水乙醇，漩涡混匀后，冰上放置 10min ，12000r ／min 离心 10min，吸去上清液。 7 、用 1ml 70%乙醇洗涤质粒 DNA 沉淀一次， 12000r ／min 离心 5min，吸去 上清液， 空气中干燥。 8 、加入 20 微升 TE 缓冲液，使质粒 DNA 完全溶解， --20℃保存。 定性定量分析： 实验步骤 实验原理 将含 pETBlue－2 的单菌 让菌苏醒，增加菌的数量。 1 落接入 3mL LBAmp 液体培养基中， 37℃振 荡培养过夜。 培养的菌液， 6000rpm， 收集、浓缩菌体。 2 离心 2min 。 去上清收集沉淀。 100 uL 溶液 I 充分重悬菌体 这一步仅仅是为了吹散细胞。 3 200uL 溶液 II ，反复颠 4 倒混匀（切勿旋涡振 利用碱法破碎细胞和提取质粒。 荡！）， 冰上放置，裂解至菌液 碱法破碎细胞是因为 NaOH可以破坏细胞膜糖苷键， SDS可以破 变清。 坏膜、变性膜蛋白。 精品文档 精品文档 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染