浙江大学细胞培养 基本技术.pptVIP

FAA 固定液： 90 ml80% 的酒精中加入冰乙酸和 40% 甲醛各 5 ml Carnoy 固定液： 60 ml 纯乙醇中加入氯仿 30 ml 及冰乙酸 10 ml Bouing 固定液： 75 ml 饱和苦味酸（ 100 ml 水中加入 1.2-1.4 g ）过滤，加入 25 ml 福尔马林（ 40% 甲醛，有沉淀时禁用），再加入 5 ml 冰醋酸（最好用前加） 4% 多聚甲醛 -PBS ： 50 ml 蒸馏水中加入 4 g 多聚甲醛，加热至 60-70 oC ，边搅拌 边逐滴加入 2 M 的 NaOH 至液体清澈透明；用 1 M 的 HCl 调 pH 至 7.4 ，冷却后加入 10 mM 的 PBS 至 100 ml 锇酸： 在棕色试剂瓶中加入 50-100 ml 的 0.1 M PBS （ pH 7.0-7.4 ），再将装有 1 g 锇酸的安培瓶放入，击碎安培瓶，摇晃使锇酸溶解 2.2 染色方法 染色是利用化学染料与细胞及各种细胞器发生化学作用和 / 或吸 附作用，使各种细胞结构能够通过染色而改变其折射率，从而 清晰的显现出来。 影响因素： 所用的固定液 染液的 pH 值：组织的酸性成分用 pH 偏高的染液，碱性成分用偏 酸染液 ? 由于 死细胞 的 细胞膜通透性 发生改变，某些染料可 大量进入却不被排出，因而细胞 呈色 。而 活细胞 反 之，能排出进入细胞内的染料，因而 不易着色 。此 法的原理即是 利用死、活细胞对染料的不同反应 而 区分开两种细胞。 ? 台盼蓝染细胞时，时间不宜过长（约 2 min ）。 台盼蓝排除检测法 ①将 1 滴细胞悬液 ( 贴壁细胞可经 0.25 ％胰蛋白酶溶 液消化后，吹打制成细胞悬液 ) 与 2 滴台盼蓝液 混 合后， 滴入细胞计数板 。 ② 2min 后，在显微镜下计数至少 200 个细胞。未着 色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞 百分比。 活体染色与细胞计数 细胞生长曲线的绘制 ? 细胞生长曲线 (cell growth curve) 是观测细胞在 一代生存期 内的 增生过程 的重要指标，可根据细胞 生长曲线分析 细胞增殖速度 ，确定 细胞传代 、 细胞 冻存 或 具体实验 的最佳时间。 ? 它以培养 时间 为 横坐标 、 细胞密度 为 纵坐标 作坐标 图。 ? 1) 培养细胞 首先在 2 ４孔培养板内分别接种 相同数量的 细胞。计数并记录接种的细 胞悬液之密度。接种时间记为 0 h 。 ? 2) 计数细胞密度 从接种时间算起，每隔 24 h 计数３孔内的细胞密度，算出平均值。为提 高准确率，对每孔细胞可计数 2-3 次。如此操作至第七天结束。 ? 3) 绘制曲线 以培养时间为横坐标、细胞密度 为纵坐标，将全部结果在坐标纸 上绘图，即得所培养细胞的生长 曲线。 ? 四唑盐（ MTT ）商品名为噻唑蓝 ? 四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于 水的蓝紫色产物（ formazan) ，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这 种功能。 ? 二甲亚砜（ DMSO ）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜 色深浅与所含的 formazan 量成正比，用酶标仪测定 OD 570nm 值。 ? MTT 法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、 肿瘤放射敏感性实验等。 四唑盐（ MTT ）比色法 ? 操作步骤 四唑盐（ MTT ）比色法 ① 100 ? L 单细胞悬液接种于 96 孔板 (5 × 10 4 ) 。 37 ℃ 、 5 ％ CO 2 培养箱中培养一段时间 ② 加入 2 mg/ml 的 MTT 液（ 50 ? L/ 孔）；继续培养 3 h 。 吸出孔内培养液后 ，加入 DMSO 液（ 150 ? L/ 孔），将培 养板置于微孔板扳荡器上振荡 10 min ，使结晶物溶解。 酶标仪检测各孔 OD 值（检测波长 570 nm ）。记录结果。 ? 高浓度血清可影响光吸收值，在加入异丙醇溶液或 DMSO 前尽量吸净培养液。 ? 吸去培养液时动作要慢 , 以免吸去形成的结晶。 1.5 细胞冻存和复苏 ? Spallanzani (1776) 最早发表了“冷”处理对“细胞”生命活动影响的 报道。 ? 1900 年前后，科学家基本上肯定了生物成分 ( 如精子 ) 能够在零下温度 贮存的事实。 ? Polge 等人 (1949) 发现了 甘油 对低温下贮存细胞的保护作用。 ? Luyet(1951) 与 Lovelock(1953) 等多位学者发现 电解质浓度增大 是造成冷 冻贮存细胞损伤的主要原因。 ? Lovelock 等人 (1959) 发现了一种新的化学保护剂，这就是现在人们熟知 的 二甲基亚砜 (DMSO) 。 ? 当前低温液氮冻存贮存细胞已是