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实验三 药物血浆蛋白结合率测定 测定方法 ? 平衡透析法 ? 超过滤法 ? 分配平衡法 ? 稳定同位素 -GC-MS 法 ? 凝胶过滤法 ? 光谱技术 平衡透析法 ? 基本原理 将蛋白置于一个隔室内，用半透膜将此隔室 与另一隔室隔开。蛋白等大分子不能通过此半 透膜，但系统中游离配基可自由通过。当达到 平衡时半透膜两侧自由配基的浓度相等。若系 统中自由配基的总量已知，测定不含蛋白隔室 中自由配基的浓度，即可推算与蛋白结合的配 基量。 重氮化偶合比色测定法 ? 具有游离氨基的磺胺药在酸性介质中重氮化后， 可与 N-(1 萘基）乙二胺产生偶合反应生成紫红色 偶氮染料，再与同样处理的磺胺药标准液比较， 即可求得磺胺药的含量。 ? 剩余的亚硝酸影响测定，用氨基磺酸胺分解除去 材料与试剂 ? 药物 10% 磺胺嘧啶钠注射液 ? 试剂 ? 15% 三氯醋酸溶液 ? 0.1% 亚硝酸钠溶液 ? 0.5% 氨基磺酸胺溶液 ? 0.1% 二盐酸 N- （ 1 萘基） - 乙二胺溶液 ? 磺胺嘧啶钠贮存标准液 ? 磺胺嘧啶钠应用标准液 ? 透析液 （ PBS ） pH7.4 的 0.02M 磷酸盐缓冲液 ? 鸡、兔各三只 ? 管状半透膜 周长 5cm ，长约 12cm ? 721 分光光度计、离心机、天平 ? 注射器、广口瓶、烧杯、三角烧瓶、试管、 试管架、漏斗、滤纸、丝线、注射器 设备与器械 试剂的配制 ? 0.02M, PH7.4 磷酸盐缓冲盐液 ( PBS) ： 贮存液： A 液： 0.2M Na2HPO4 Na2HPO4· 12H2O 71.64 克，加蒸馏水至 1000ml ； B 液： 0.2M NaH2P4 NaH2P4· 2H2O 12 克，加蒸馏水至 1000ml ； 应用液：取 A 液 81ml 加 B 液 19ml 混合，再以生理盐水 作 10 倍稀释即成。 试剂的配制 ? 0.1% 二盐酸 N- （ 1 萘基） - 乙二胺溶液 0.5 g 溶于 95 % 乙醇约 400 mL 中，再用乙醇稀释至 500ml ， 棕色瓶于冰箱中保存 ? 贮存标准液 取标准品 0.125g 溶于蒸馏水中，并 稀释至 1000mL 。如不溶于水，可先溶于 0.1 mol/L 氢氧化钠 25mL 中，再加 4mol/L 硫酸 175 mL ，用蒸馏水稀释至 1000mL 。 ? 应用标准液 精确吸取贮存标准液 3mL ，置 100 mL 容量瓶中，用 3% 三氯醋酸稀释至刻度。 操作步骤 1. 血浆的制备：兔心脏采血（鸡翼静脉采血）， 肝素抗凝，以 3000rpm 离心 10min ，上清液即 为血浆。 2. 将管状半透膜一端折叠，用纱线扎紧，保留结 扎线段 10cm 左右，以调节袋内外液面在同一水 平，加血浆样品 2.0ml 于上述半透膜袋内，并扎 紧口袋另一端。注意：袋口不得污染血浆。 3. 将两端扎紧的半透膜置于盛有 9.75ml 透析液的 30ml 广口瓶中，用袋两端线段调节袋内外液面 4. 加 2.0ml 透析液代替血浆于半透膜袋内，作平 衡时间对照样品，以确定药物从袋内外自由扩 散达到平衡所需时间。 5. 加所试磺胺药溶液 0.25ml 于各瓶袋外透析液中。 注意：容积越小越好，以免影响透析液的组成 6. 置广口瓶于冰箱中，平衡透析时间约需 60h 左 右。 7. 待透析平衡后，吸出袋外透析液少许，加等 量磺基水杨酸试剂，检查有无血浆蛋白漏出。 如检查为阳性，则该样品作废。 8. 取出半透膜，用滤纸吸干袋外壁透析液，小 心解开透析袋，使袋内血浆流入干净试管。 9. 用重氮化 - 偶合比色法测定袋内外溶液中磺胺药浓度 ? 取袋内外溶液各 0.5ml ，加水 15.5ml ；加 15% 三氯醋 酸 4ml ，混匀，静置 2min ，过滤 取试管 3 支，各加入滤液 5mL ，为测定管 取试管 3 支，加入空白对照液 5mL ，为空白管 取试管 3 支，加入应用标准液 5mL ，为标准管 ? 在以上各管中各加入 0.1% 亚硝酸钠溶液 0.5mL ，混 匀，放置 3min ? 各加入 0.5% 氨基磺酸胺溶液 0.5mL ，混匀，放 置 2min ? 各加入