细胞培养试剂的配置.pdfVIP

精品文档 器材与试剂 干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素 . 纯净水系统、电子天平、 PH计、磁力搅拌 器等 具体步骤 1. 水： 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水 . 2. PBS ( 也可用于其它 BSS，如： Hanks，D-Hanks 液的配制 ) ： 主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗 溶解定容：将药品（ NaCl 8.0g ，KCl 0.2g ，Na2HPO4·H2O 1.56g ，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水 的烧杯中， 玻璃棒搅动， 充分溶解， 然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至 1000ml ，摇匀即成新配制的 PBS 溶液。用 HCl 或 NaOH调 PH到 7.4 。 移入溶液瓶内待消毒：将 PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内 8 磅消毒 20 分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 3. 胰蛋白酶溶液： 胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反 应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在 pH 为 8.0 、温度为 37 ℃时，胰酶 溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因 Ca2+、 Mg2+和血清、 蛋白质克降低胰酶的活性， 所以配制胰酶溶液时应选用不含 Ca2+、Mg2+的 BSS，如：D-Hanks 液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。 称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为 0.25 ％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若 用双蒸水需要调 PH到 7.2 左右）或 PBS （D-hanks ）液中。搅拌混匀，置于 4 ℃内过夜。 用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（ 0.22 微米微孔滤膜）抽滤除菌。 然后分装成小瓶于 -20 ℃保存以备使用。 4. 0.05 ％胰蛋白酶－ 0.02%EDTA溶液 称取胰蛋白酶粉末（ 1：250） 0.05g ，EDTA 0.02g ，加入 PBSA 100ml，0.22um 微孔滤膜过滤除菌， 分装，于－ 20℃保存。 5. 青、链霉素溶液： 所用纯净水（双蒸水）需要 15 磅高压 20 分钟灭菌。 具体操作均在超净台内完成。青霉素是 80 万 单位 / 瓶，用注射器加 4ml 灭菌双蒸水。链霉素是 100 万单位 / 瓶，加 5ml 灭菌双蒸水，即每毫升各为 20 万单位。 分装于－ 20 ℃保存。使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为 100 单位 /ml 。 6. RPMI1640 ： 溶解、 调 PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积 2/3 的双蒸水中 , 并用双蒸水冲洗包装袋 2-3 次 ( 冲洗液一并加入培养基中 ), 充分搅拌至粉剂全部溶解 , 并按照包装说明添加一定的药品 . 然后用注射 器向培养基中加入配制好的青链霉素液各 0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为 100 单位 /ml 。然后用二氧 化碳或碳酸氢钠调 PH到 7.2 左右。最后定容至 1000ml，摇匀。 安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸 下支架腿分别用布包好待消毒。 抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。 。