棉花BFT和APs基因的全基因组分析.pdfVIP

摘要 BROTHER OF FT AND TFL1 (BFT)被称为FLOWERING LOCUS T (FT)和TERMINAL FLOWER1 (TFL1) 的兄弟，在植物开花通路中发挥着重要的调控作用。在盐胁迫下，拟南芥BFT 蛋白在顶端分 生组织中同bZIP 转录因子FD 互作，形成复合物调控开花转变。实验室前期构建了新陆早33 叶组 织的酵母双杂cDNA 文库，并从中筛选出一个与陆地棉开花促进因子GhFT1 蛋白互作的天冬氨酸类 似蛋白(Aspartic proteinases, APs)，该蛋白酶基因在植物生长发育、抗病及逆境胁迫过程中起着重要 作用。 目的：全基因组鉴定棉花BFT 和GhAPs 基因，通过生物信息学分析，初步预测GhAPs 可能存在的 生物学功能；利用蛋白互作和转基因拟南芥研究，探索GhBFT 在开花调控中的功能。 方法：基于最近更新的棉花基因组数据库，鉴定棉花BFT 和GhAPs 基因；RT-PCR 技术克隆GhBFT1 和GhBFT2 基因；实时荧光定量PCR 技术检测GhBFT1 和GhBFT2 基因表达特征；酵母双杂交(Yeast two-hybrid, Y2H)和双分子荧光互补技术(Bimolecular fluorescent complimentary assay, BiFC)技术共同 探究GhBFT 蛋白与陆地棉FD 蛋白之间的相互作用；构建植物表达载体35S:GhBFT1，采用农杆菌 介导的花滴法转化野生型拟南芥。 结果：1、棉花BFT 基因的全基因组分析：(1)棉花数据库中共鉴定了12 个BFT 同源基因，其中四 倍体陆地棉和海岛棉中均发现了4 个BFT 基因，二倍体亚洲棉和雷蒙德氏棉中各有2 个BFT 基因； (2)棉花BFT 基因均由4 个外显子和3 个内含子组成，且1 号和4 号外显子相对较大；BFT 蛋白间理 化性质相似性较高，且具有相同的保守基序和保守结构域(D-P-D-x-P; G-x-H-R) ；(3)克隆的GhBFT1 和GhBFT2 基因均来自于D 亚基因组，其ORF 长度分别为525 bp 和522 bp ；(4) GhBFT1 和GhBFT2 基因均在陆地棉叶中表达量最高，花中次之，且GhBFT1 在各组织中表达量显著高于 GhBFT2 ；(5) GhBFT1 和GhBFT2 不同程度地响应盐、干旱、ABA 及高低温胁迫，并具有相似的表达特征；(6) Y2H 和BiFC 实验证明GhBFT1 和GhBFT2 均能与陆地棉GhFD 1、GhFD2 、GhFD3 和GhFD4 蛋白互作； (7) 35S:GhBFT1 过表达拟南芥，导致其开花延迟，莲座叶数目增加。 2、棉花APs 基因的全基因组分析：(1)陆地棉中共鉴定了87 个GhAPs 基因，其中83 个拥有两 个完整的ASP 保守位点；(2)系统进化树将其聚类为典型(Typical) (A)、类珠型(Nucellin-like) (B)和非 典型(Atypical) (C)三大类，各亚组成员在基因结构、保守基序及氨基酸序列间存在一定的差异；(3)染 色体定位显示 GhAPs 基因在除A04 外的所有染色体上均有分布，且发现5 对串联重复基因；(4)共 线性分析发现，GhAPs 基因间存在大量的共线性，且每个GhAPs 基因与1~4 个基因间存在共线性关 系；(5)启动子顺式作用元件预测显示，GhAPs 基因启动子含有光、激素(ABA、GA、IBA 和MeJA) 、 逆境胁迫(干旱、低温、抗氧化、防御和应激性)、昼夜节律、分生组织表达、胚乳表达和细胞周期调 控等相关元件；(6)组织表达分析结果表明，GhAPs 在陆地棉的根、茎、叶、花瓣、雌蕊、萼片、苞 片、花托、花药和花丝及不同发育时期的胚珠和纤维中均不同程度表达。 结论：1、棉花基因组中共含有12 个BFT 基因，陆地棉和海岛棉中均含有4 个，亚洲棉和雷蒙德氏 棉中各有2 个；GhBFT1 和GhBFT2 在叶和花中表达量较高，响应盐、干旱、ABA 及高低温胁迫； GhBFT1 和GhBFT2 与陆地棉中4 个FD 同源蛋白互作；拟南芥中异位过表达GhBFT1，导致转基因 拟南芥延迟开花，表明GhBFT 可能与FT 竞争结合FD 蛋白，从而抑制开花转变。 2、陆地棉中共鉴定了87 个可能的GhAPs 基因家族成员，分为A 、B 和C 三大亚组，各亚组成 员基因结构、保守基序和氨基酸序列间存在差异性，预示其可能具有功能多样性；GhAPs 在进化过 程中可能发生了