棉花抗枯萎病相关基因GhWRKY48的克隆及功能初步分析.pdfVIP

摘 要 目的：棉花枯萎病是影响我国棉花产量和品质的最重要病害之一，挖掘抗病相关基因是利用转基因 技术培育棉花抗枯萎病品种的基础。植物转录因子在抗病信号途径中起着重要作用，其中WRKY 转录 因子在植物抗病中必不可少的。本实验是从陆地棉抗病材料中克隆棉花抗枯萎病相关WRKY 转录因子 基因GhWRKY48，分析该基因的表达特性，并初步研究其功能，为棉花抗枯萎病分子育种提供基因资 源。 方法：本实验以枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱中筛选得到WRKY 基因片段为探针，通过电子克隆 技术从高抗枯萎病的陆地棉中克隆 WRKY 转录因子基因 GhWRKY48。通过实时荧光定量 PCR 分析 GhWRKY48 基因在枯萎病菌、水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ET）胁迫下的表达方式；利用VIGS 沉默技术初步研究该基因功能。 结果：1、从抗病棉花品种 “中棉所12”号根部cDNA 中克隆得到一个抗枯萎病相关的WRKY 转录因 子。通过多序列比对分析该基因属于第Ⅱ类WRKY 转录因子家族，将其命名为GhWRKY48。序列分析发 现，该基因cDNA 全长为 1074 个核苷酸，编码了357 个氨基酸，含有 1 个WRKY 结构域及 1 个C2H2 型锌指结构。 2、对 GhWRKY48 基因进行生物信息学分析，其中在编码的蛋白质理化性质分析中发现，编码蛋白分 子量为3.94kD，脂肪指数为56.86，等电点6.20，属于疏水蛋白。蛋白二级结构包括延伸链、α螺 旋和无规则卷曲。对GhWRKY48 的蛋白磷酸化位点进行预测，发现主要包括三种磷酸位点：分别是苏 氨酸(Threonine) （7 个）、丝氨酸(Serine) （18个）和络氨酸(Tyrosine) （23 个）。 3、qRT-PCR 分析发现，枯萎病菌处理后，GhWRKY48 的表达量都显著低于对照组。分别用JA、SA、ET 处理抗病品种‘中棉所12 号’，发现SA 和JA 均能诱导GhWRKY48 基因表达。SA 处理后，GhWRKY48 的表达量显著低于水处理的对照；JA 处理后发现，GhWRKY48 的相对表达量明显高于SA 处理，呈先 增加后降低的变化趋势，在处理后的3h，其表达量显著低于水处理的对照，而在其它时间点，该基 因的相对表达量均低于对照组Mock，但差异不显著。ET 处理后，该基因的相对表达量变化不明显。 4、利用非保守区段构建GhWRKY48 基因的干扰片段TRV2-GhWRKY48-CO，qRT-PCR 检测，沉默效率约 为70 左右%，表型观察和恢复培养结果显示，沉默了GhWRKY48 基因的棉花和空载相比对枯萎病菌更 敏感，沉默棉株的萎蔫程度、发病株数和病情指数均高于对照植株。通过对相关酶的活性分析，发 现，沉默植株的CAT、PPO、POD 和PAL 的酶活性均显著低于空载植株。 结论：克隆获得的GhWRKY48 基因，利用实时荧光定量PCR 技术证明该基因对枯萎病、水杨酸、茉莉 酸均有一定的响应，通过VIGS 技术干扰GhWRKY48 基因表达，结果表明GhWRKY48 基因参与了棉花 抗枯萎病反应。 关键词：棉花；枯萎病；GhWRKY48；qRT-PCR；VIGS 基因沉默 V Abstract Objective: Cotton Fusarium wilt is one of the most terrible diseases that affect the yield and quality of cotton in our country. Mining disease resistance related genes is the basis of using transgenic technology to cultivate cotton varieties resistant to Fusarium wilt. Besides, plant transcription factors play an important role in disease resistance signaling pathways, among which WRKY transcription factors are essential in plant dis