WesternBlot实验蛋白质印迹法.pptVIP

WB 实验细节详述 时间： 2016-05-07 一：蛋白定量（实验前处理） ? 组织：到手的组织状态：冰袋快递：组织腐烂，蛋白含量减少 干冰快递：基本无影响 甲醛处理：石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒 需用匀浆器，液氮等方法加入 1*PBS 充分研磨 裂解液量：组织（ g ）：裂解液（ ml ） =1:10 细胞：一般为细胞悬液实验前需确定细胞大概浓度 裂解液量： 10 7 数量细胞加入 1ml 裂解液 一：蛋白定量（裂解液详述） 裂解液使用时加入 PMSF ： 1ml 裂解液加 1ulPMSF PMSF （苯甲基磺酰氟）是一种蛋白酶抑制剂，可抑制丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝 乳蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶） PMSF 在水液体溶液中不稳定，见水易分解，需使用前加入。 RIPA 裂解液： （ 100ml 体系） 试剂名称 配方 作用 Tris (pH 7.4) 50mM 生物缓冲液 NaCl 150mM 让蛋白处于正常条件下，避免蛋白构象改变 Triton X-100 中性去垢剂 1% 保持蛋白天然构象，提高细胞膜的通透性 sodium deoxycholate （ 脱 氧胆酸钠 ）阴离子去垢剂 1% 裂解细胞，溶解蛋白（尤其是难溶于水的膜蛋 白） SDS 阴离子去垢剂 0.1% 破坏蛋白分子的二、三级结构使分子被解聚成 多肽链，解聚后的氨基酸侧链和 SDS 结合成蛋 白 - SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白 原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电 荷差异和结构差异。 一：蛋白定量（原理） ? 在碱性环境下蛋白质与 Cu 2+ 络合并将 Cu 2+ 还原成 Cu 1+ 。 BCA 与 Cu 1+ 结合形成稳定的紫蓝色复合物，在 562 nm 处有高的 光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此制作标准曲线做对 比，即可计算待测蛋白的浓度。 一：蛋白定量（实验过程） ? 加标样 + 水（共 10ul ） 样品 5ul+ 水 5ul ? 混匀放置 37 ℃培养 30min, 测 OD 值， 562nm 标样 (ul) 0 1 2 4 6 8 10 水 (ul) 10 9 8 6 4 2 0 加入 200ul （ A+B) 工作液， A 液： B 液 =50:1 一：蛋白定量（数据处理） OD 蛋白浓度（ ug/ul ） 最大上样量为 35ul 蛋白浓度 30ug 保证每个孔蛋白量相同 二： 聚丙烯酰胺凝胶电泳（配胶） ? 分离胶 试剂 分离胶浓度 6% 8% 10% 12% 15% 18% 分子量（ kDa) ≥94 70-94 55-70 20-55 10-20 ≤ 10 去离子水（ ml ） 5.3 4.6 4.0 3.3 2.3 1.3 30 ％丙烯酰胺（ ml ） 2 2.7 3.3 4.0 5.0 6.0 1.5MTris － HCl （ PH8.8 ）（ ml ） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 10 ％ SDS （ ml ） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 10 ％ AP （ ml ） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 TEMED （ ul ） 0.008 0.006 0.004 0.004 0.004 0.004 总体积（ ml ） 10ml （两块胶的量） 作用：使蛋白样品分离 对于分离胶来说， pH8.8 与甘氨酸的 pka 接近，从而使不同分子量的蛋白产生不 同的泳动速度，从而使不同分子量的蛋白分开。 二： 聚丙烯酰胺凝胶电泳（配胶） ? 浓缩胶 作用：使蛋白样品浓缩 对于浓缩胶来说， pH6.8 可以 通过甘氨酸和和氯离子的作 用产生压缩，从而使蛋白条 带压细。 试剂 浓缩胶浓度 5% 水（ ml ） 2 30 ％丙烯酰胺（ ml ） 0.5 1.0MTris － HCl （ PH6.8 ） (ml) 0.38 10 ％ SDS （ ml ） 0.03 10 ％ AP （ ml ） 0.03 TEMED （ ul ） 0.03 总体积（ ml ） 3 （两块胶的量） ? 制分离胶时 10%AP 加入后迅速混匀再加 TEMED 制胶，沿壁灌注，灌 注时尽量不要产生气泡，如有气泡，用移液器将气泡吸出，留出浓缩 胶所需空间（梳齿长再加 1cm ）。 ? 覆盖水层于分离胶溶液上，夏天将制胶器放室温 20min ，冬天放 37 度 培养箱 20min-30min ? 待分离胶和水层之间会出现清晰界面，表明分离胶充分聚合（可微微 倾斜模具，检测凝胶是否聚合），倒掉并用滤纸吸干水 ? 在已聚合分离胶上直接灌注浓缩胶液体，立即插入加样梳（缓慢插入， 避免产生气泡）。将凝胶在室温或者 37 ℃静置 20-30min （视具体情 况而定），直到浓缩