标记HRP——简易过碘酸钠法.pdfVIP

精品文档 标记 HRP—— 简易过碘酸钠法 1. 原理： 经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭 HRP上残留的 α- 和 ε 氨基基以避免酶分子之 间的交联。后来 Wilson 等改用在低 PH下使 NaIO ４氧化 HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭 HRP步骤。 HRP经 NaIO４氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后 者可进一步用 NaBH４( 或乙醇胺 ) 还原生成稳定的酶标记抗体 试剂及器材 (1) 0.1M NaIO ４：称取 241mg高碘酸钠溶于 10ml 蒸馏水中。 (2) 1mM PH4.4 醋酸钠缓冲液 : 0.2M NaAc (1.361 克／ 50ml) 3.7ml 0.2M HAc (0.601ml ／50ml) 6.3ml 加蒸馏水至 2,000ml 。 (3) 0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液 : Na２CO３ 0.32 克 NaHCO３ 0.586 克 加蒸馏水至 50ml 再用蒸馏水作 20 倍稀释，即成 0.01M PH9.5 的碳酸盐缓冲液。 (4) NaBH４溶液 (4mg ／ml): 临用时称取 NaBH４4mg溶于 1ml 蒸馏水中。 (5) 0.15M PH7.4 PBS （6 ） 饱和硫酸铵 操作步骤 (1) 称取 5mgHRP溶解于 1ml 蒸馏水中。 (2) 于上液中加入 0.2ml 新配的 0.1M NaIO ４溶液，室温下避光搅拌 20 分钟。 (3) 将上述溶液装入透析袋中，对 1mM PH4.4 的醋酸钠缓冲液透析， 4℃过夜。 1 。 欢迎下载 精品文档 (4) 加 20 μl 0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯 RP 的 PH升高到 9.0 ～9.5 ，然 后立即加入 10mg IgG( 抗体，或 SPA5mg)在 1ml 0.01M 碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅 拌 2 小时。 (5) 加 0.1ml 新配的 4mg／ml NaBH４液，混匀，再置 4℃2 小时。 (6) 将上述液装入透析袋中，对 0.15M PH7.4 PBS透析， 4℃过夜。 (7) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置 4 ℃ 1 小时。 (8) 3000rpm 离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量 0.15M PH7.4 的 PBS中。 (9) 将上述溶液装入透析袋中， 对 0.15M PH7.4 的 PB缓冲盐水透析， 去除铵离子后 ( 用萘 氏试剂检测 ) ，10,000rpm 离心 30 分钟去除沉淀， 上清液即为酶结合物， 分装后， 冰冻保存。 结果判定 定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定 ( 光程 1cm) 。 酶量 (mg ／ml) ＝OD403nm×0.4 IgG 量 (mg ／ml) ＝(OD280nm-OD403nm×0.3) ×0.62 酶量 (mg ／ml) IgG 量 (mg ／ml) 酶量 克分子比值＝ ──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4