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人的外周血淋巴细胞培养 摘 要 ： 正常情况下哺乳动物的外周血中没有分裂相，这是由于外周血中的小淋巴细胞大 多处于 G 期。但在一定条件下，外周血中的小淋巴细胞受刺激转化成淋巴母细胞，随后进 0 入有丝分裂。 本实验介绍人外周血淋巴细胞的培养方法， 染色体标本的制备和正常人染色体 的组型分析。 [1] 关键词 ： 外周血淋巴细胞 低渗处理 空气干燥法 染色体组型分析 前 言：人体外周血细胞培养是制备染色体标本的常用方法。此方法取材方便，用血量少， 操作简便。 1960 年 Nowell 和 Morhead 验证，使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物凝集素 （phytohaemagglutinin ，PHA ）是人和其他动物淋巴细胞的有丝分裂的刺激剂。在 PHA的作 用下，原来处于 G 期的淋巴细胞转换为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。这样经过短期培 0 养， 以秋水仙素或其衍生物秋水仙胺进行处理， 经过低渗和固定， 就可获得大量的处于有丝 分裂时期的细胞 [2] ，因为秋水仙素 ( 或秋水酰胺 ) 可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成， 使 细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染 色体分中期 分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈 现明显形而利于辨认。 淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，经过空气干燥法制片。所 谓空气干燥法， 实际上是将细胞经过秋水仙素—低渗处理—充分的固定—滴片等步骤之后再 载玻片上得到染色体制片的技术。 有时， 有人把滴片的步骤叫做染色体分散， 也有人把这一 步和随后的干燥称为空气干燥法。 “空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载玻片 在室温中自然干燥的方法。 [3] 淋巴细胞的培养已成为制备染色体的最主要的方法。因为该法材料便宜易得，对同一 个体可进行连续观察，并可得到优良的染色体制片。各种因素的作用效应（如病毒、电离辐 射、化学试剂等） 可在淋巴细胞的培养条件下进行观察， 从而可进行多种在体内无法进行的 研究。本方法已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 [2] 染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是： (1)低渗处理：目的是使水分通过 细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞， 染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处 理还可使红细胞质膜破裂， 经后血影浮于上清中被去除， 后续的固定过程主要针对淋巴细胞， 改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。 (2) 固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近 存活的状态， 以便作进一步处理， 若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。 染色 体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸 (3 ：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组 织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较 好的固定效果。 1.材料方法 1.1 材料 人的外周血淋巴细胞。 1.2 器具 采血针、 20mL 培养瓶、毛细管、离心管、载玻片和盖玻片、显微镜、恒温箱、离心机、 电子天平、分析天平、精密 PH 试纸、移液管、烧杯、酒精灯、移液枪 1.3 药品 1.3.1 RPMI “1640 培养基” 称取 “1640粉末” 1.05 g，用 100 mL 的双蒸水溶解，溶解后