第一章基因和基因组及基因工程的概念.pptxVIP

基因工程（三）;九、目的基因的高效表达;（一）、基因表达的基础知识; 1-3 遗传密码： 3个碱基编码一个氨基酸，这三个碱基被称为三联体密码或密码子;;2 核糖体：合成蛋白质的“工厂” 核糖体由两个亚基构成，一个较大，一个较小 原核生物;3.蛋白质的合成机理（以原核生物为例）;合成的步骤：新进入的酰胺-tRNA结合到核糖体上——肽链的形成——移位 合成的终止：识别终止信号： UAG，UAA，UGA ; 4-1 信号肽：在真核生物中，当某一种多肽的N－末端刚开始合成不久，这种多肽的取向就被决定，这是因为受这个N末端的信号肽的控制。 在细菌中，也存在类似情况，新生肽的N－末端也有一段信号肽结构，有时也叫引导肽;;原核生物只有一种RNA聚合酶(真核细胞有三种)识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 原核生物的表达是以操纵子为单位的。 由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的;④ 原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。 ⑤ 原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。 ⑥ 在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA 3，末端碱基互补的序列，即SD序列，而真核基因则缺乏此序列。;（三）、提高目的基因高效表达的途径;1、目的基因转录和翻译方面;1-2 转译起始序列对翻译水平的影响 翻译水平的影响外源基因的表达的重要因素是翻译起始区。翻译是在核糖体上进行，SD序列对翻译是必须，而且它也能影响到翻译的效率。 ;1-3 充分考虑宿主菌对密码子的偏爱性 大肠杆菌不同密码子的偏爱性问题，将64组密码子分为强、中、弱密码子。;2 目的产物方面;2-2目的基因的高效可溶性表达;2-3目的基因的高效分泌表达;3 宿主菌改造;3-2 遗传改造工程菌的输氧能力，不再使贫氧成为工程菌限制因子。因为，在一般情况下，溶解氧是菌体生长的限制因子。;4 .宿主菌培养方面;4—1提高工程菌的质粒稳定性;4－2重组体的高密度培养;（2）流加（补料）发酵实现高密度重组菌培养 ;（3）减少乙酸等抑制性副产物的形??? 大肠杆菌、枯草杆菌和哺乳动物细胞培养时分别会产生乙酸、丙酸及乳酸等移植性产物 危害：影响细胞生长，抑制产物表达 改进措施（以大肠杆菌为例）： 降低比生长速率 降低培养温度 限制性的加葡萄糖 基因工程菌培养和乙酸分离耦合过程; （四）、目的基因高效表达规律;十、基因工程的应用;第一个基因重组产品，也是第一个基因工程药物——人胰岛素于1982年在美国问世 我国第一个基因工程药物干扰素-α1b 于1989年上市;2、基因工程药物 激素和多肽类：缺乏天然内源性蛋白所引起的疾病，如人胰岛素、人生长激素、降钙素和细胞生长调节因子 酶类：利用催化反应，达到治疗目的，如tPA, 尿激酶和链激酶等 重组疫苗：防止病毒引起的人和动物传染性疾病疫苗。 单克隆抗体：既可用于疾病诊断，也可用于治疗。 ;;3 举例：糖尿病、胰岛素与基因工程;胰岛素的结构和作用;在生物体内，胰岛素是在β细胞内质网的核糖体上合成的，其合成过程是：前胰岛素原 胰岛素原 胰岛素 胰岛素原，它可以看成是有一条连接肽（简称C肽）的一端通过两个碱性氨基酸（第62、63位）与胰岛素A链的N末端相连，另一端通过与另外两个碱性氨基酸残基（第31、32位）与B链C末端相连。不同种属动物的C肽不同，例如人的31肽，猪的29，牛的26。胰岛素原保证了胰岛素折叠卷曲，保证了三个位置正确的二硫键的形成。 前胰岛素原，它比胰岛素原的Ｎ末端上多一段肽链，即信号肽，含20个氨基左右，其中多是疏水侧链残基。 生成过程：前胰岛素原在信号肽的引导下进入内质网腔。待肽链进入腔后，立即被信号肽酶切去“前”顺序。形成的胰岛素原后，又被运输到高尔基体然后贮存在贮存颗粒中，并在特异肽酶的作用下转变为活性胰岛素，肽酶催化胰岛素原的二个特定肽键的断裂，释放出一段中间的肽链，这个端肽链又在肽酶的作用下从链的两端各除去2个氨基酸残基而生长C肽。 ;;胰岛素的化学合成;获得基因途径1：Itakura等人提出的，通过化学合成胰岛素基因再重组表达，即先几十个DNA片段，然后连接起来分别得到A链和B链基因，然后把这两个基因分别表达，再组合成人胰岛素。 但这个方法，二硫键正确配比率比较低，后来有人就合成简化的C肽基因，再连接A、B链构成胰岛素原基因。;获得目的基因途径2： 将前胰岛素原的mRNA反转录成cDNA。;在大肠杆菌中表达途径：;在大肠杆菌中表达途径2：;在酵母中表达;基因治疗糖尿病;转移基因的靶细胞;