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细胞培养的操作步骤 一、原代培养及其操作步骤 原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一 型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、 生长和繁殖。 原代培养细胞常有不同的细胞成分， 生长缓慢， 但是更能代表所来源的组织细 胞类型和表达组织的特异性特征。 利用原代细胞培养做各种实验， 如药物测试、 细胞分化及 病毒学方面的试验效果很好。其操作步骤如下。 1. 剪切组织 先将所取得的组织，用 D-Hanks 或 Hanks 液清洗，以去除表面血污，并 用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织。 再次清洗后， 用手术刀将组织切成若干小 块，移入 青霉素小瓶 或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组 织成糊状， 约1mm3大小。 静置片刻后， 用吸管吸去上层液体， 加入适当的缓冲液再清洗一次。 2. 消化分离 消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细 胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。 3. 培养 细胞悬液用计数板进行细胞计数。用培养液将细胞数调整为（ 2～5 ）×105 cells ／ml ，或实验所需密度，分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底 部为宜。置 CO2培养箱内， 5 ％CO2，37℃静置培养。一般 3～5d ，原代培养细胞可以黏附于 瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量 1 ／2的新培养液，继续培养 2～3d 后换液，一般 7～ 14d 可以长满瓶壁，进行传代。 4. 注意事项 （1）无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操 作观念，以预防为主，一旦污染，一般很难消除。 （2 ）培养液：所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。由于细胞来源的动 物种类、 组织类型不同， 对培养液的要求有一定的差异， 必要时可用预实验的方法选择适当 的培养液。 （3）小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用。 可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析。一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后， 就保持应用至实验完成。 （4 ）胶原酶溶液：必须新鲜配制，贮存时间过长 ( 即使是 - 20℃低温保存 ) ，也将影响 消化效力，导致消化时间过长，细胞损伤增加。 （5）L- 谷氨酰胺：几乎所有细胞对谷氨酰胺都有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成 核酸和蛋白质， 在缺少谷氨酰胺时， 细胞会因生长不良而死亡。 谷氨酰胺在溶液中很不稳定， 加有谷氨酰胺的培养液在 4℃冰箱贮存两周以上时，就应重新加入原来量的谷氨酰胺。 （6）静置培养：原代细胞在消化分离后，置于 CO2培养箱的头 24～48h ( 必要时 72h) 内，应处于绝对静置状态， 切忌不时地取出培养瓶观察生长状况， 这将使原代分离细胞难以 贴壁， 更谈不上伸展和增殖，初学者尤应注意。不必担心培养液中的营养成分会消耗光，在 细胞增殖之前对营养的要求并不大。 原代培养初期仅加一薄层培养液的目的也在于有利于细 胞贴壁伸展。 （7）消化时间：一般消化至肉眼尚可见微小组织颗粒即可，因为此时组织颗粒已经松 散，略经吹打即成细胞团或单个细胞， 过久的消化往往导致细胞损伤加重， 细胞培养成活率 降低。 （8）其他生长因子：经过以上处理，一般原代分离细胞培养均可以成功。对于少数特 殊类型细胞也可以考虑加一些特殊的生长因子，如胰岛素能促使细胞摄取葡萄糖和氨基酸。 另外，内毒素、 EGF、FGF等均有促有丝分裂作用，但费用较高。 二、传代培养及其操作步骤