实习二细胞存活曲线测试与结果分析.pdfVIP

实习二 细胞存活曲线测试与结果分析 一、 目的要求 实习目的是了解克隆形成法检测细胞存活曲线实验方法的原理与基本步 骤，熟悉细胞存活分数与受照剂量（Gy）之间的剂量－效应关系，以及与存活曲 线结果分析处理有关的软件使用，掌握细胞存活曲线的测试、绘制与结果分析的 正确方法。 具体要求：1，计算细胞接种效率PE；2，应用SPSS软件计算单击多靶模型 下不同的 n和 k值，正确阅读运算结果；3，根据实际获得的 n和 k值，进一步 计算出 D 、Dq和 D 值，以及增敏比 SER；4，利用EXCEL软件计算出不同剂量照 0 37 射下细胞的理论存活分数预测值，绘制存活分数预测值与照射剂量间的剂量效应 曲线。 二、 实验原理 放射生物学中细胞死亡是指细胞丧失完整增殖能力的一种死亡。当细胞受到 电离辐射照射后，受照细胞可呈现“间期死亡” ，或曰即刻死亡，也可能呈现 为“增殖性死亡”，即受照细胞形态上仍然保持完整，而且有能力制造蛋白质、 合成 DNA，甚至还能再经过一次或n次有丝分裂后，才突然变性死亡。鉴于上述 细胞死亡定义和照射后细胞死亡的实际情况，细胞放射生物学通常采用细胞克隆 （集落）形成试验来检测照射后细胞的存活状况。细胞克隆是在体外培养时由一 独立的单个健康存活细胞直接分裂增殖而形成的细胞群体。在计数克隆数目时， 通常把含 50个以上细胞的克隆计为一个细胞集落，代表一个存活细胞。 在描述细胞存活分数 （SF,survivalfraction）与电离辐射吸收剂量 （Dose, Gy）间的定量关系时，通常有单击单靶和单击多靶两种模型。而哺乳类细胞受照 后存活曲线多近似地符合单击多靶模型。根据模型对原始数据进行拟合分析可以 获得细胞存活曲线的数学表达式及其具有生物学意义的一些参数。例如在单击多 靶细胞克隆存活模型中，Dq值的大小反映细胞抵抗电离辐射修复亚致死损伤的 能力。因此电离辐射细胞存活实验就是要通过检测与拟合细胞存活曲线，获得诸 如 D 、Dq、k和 n等一系列参数，从而根据这些参数对细胞的放射敏感性作出定 0 量的评价。 三、 细胞存活曲线实验的基本步骤 1 细胞准备与照射 细胞照射前，取体外培养处于对数生长期的人宫颈癌 细胞HeLa 细胞，用0.125%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，计数细胞浓度。设假 照射对照组和0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 和10.0 Gy 7 个照射组，每组设 2 3 个平行实验瓶。于25cm 培养瓶中，按剂量分组每瓶分别接种细胞100、200、 400、1000、2000、4000、8000、16000 个细胞，于37℃，5% CO 下正常培养。 2 接种6－12 小时后细胞已贴壁生长，将培养细胞转移至钴源室接受照射处理。其 中，假照射对照组细胞不接受照射处理。 细胞培养、克隆计数与平均存活分数（SF）的计算 将接受照射后的细胞 放回细胞培养箱继续培养，每三天更换新鲜培养液一次。待培养至10－14 天后 弃去培养基，用0.5%结晶紫染色贴壁细胞。计数并记录不同照射剂量下各组培 养瓶中细胞存活克隆个数。根据假照射处理组细胞克隆形成数目，计算细胞接种 效率（PE）；各照射处理组细胞存活分数（SF）为各组细胞克隆形成的平均数除 以相应细胞接种数与接种效率的乘积。 细胞存活分数（SF）与辐射剂量之间数学模型的建立 哺乳细胞接受不同剂量的电离辐射照射后，细胞存活的规律大多是符合单击 多靶细胞存活模型，即 SF＝1-[1-EXP （-k*D）**n]。根据实验实测细胞存活数 2 据进行该数学模型的非线性回归拟合分析，可获得单击多靶细胞存活模型的一系 列有意义的参数，如k、n、D 、D 和Dq。其中，k 为细胞存活曲线的钝化常数， 0 37 其值可由拟合曲线方程直接给出；