嗜热毛壳菌蛋白表达系统构建及多糖单加氧酶性质研究.pdfVIP

符号说明 BGs ：Endocellulases ，内切纤维素酶 Bp ：base pair ，碱基对 CBHs ：Cellobiohydrolases，纤维二糖水解酶／外切葡聚糖酶 DNA ：Deoxyribonucleic Acid ，脱氧核糖核酸 EGs ：Endoglucanases ，内切葡聚糖酶 G1 ：glucose，单糖／葡萄糖 G2 ：cellobiose，纤维二糖 G3 ：cellotriose，纤维三糖 G4 ：cellotetraose，纤维四糖 G5 ：cellopentaose，纤维五糖 G6 ：cellohexose，纤维六糖 G7 ：celloheptaose，纤维七糖 GLA: Glucohydrolase，葡萄糖淀粉酶 GPD: Glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase ，3-磷酸甘油醛脱氢酶 KD ：Kilodalton ，千道尔顿 SDS：Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，聚丙烯酰胺凝胶电泳 PASC ：Phosphoric Acid-Swollen Cellulose，磷酸膨胀纤维素 PCR ：Polymerase Chain Reaction ，聚合酶链式反应 PMOs ：Polysaccharide Monooxygenases ，多糖单加氧酶 TLC ：Thin-Layer Chromatography ，薄层层析色谱 Vc ：Vitamin C ，维生素C 目 录 中文摘要I Abstract III 1 引言 1 1.1 微生物表达重组蛋白的现状 1 1.2 提高丝状真菌蛋白表达策略 1 1.2.1 使用丝状真菌内源强启动子 2 1.2.2 构建高效表达宿主菌 3 1.2.3 基因融合 3 1.2.4 增加基因的拷贝数 4 1.3 嗜热真菌研究进展 4 1.3.1 嗜热真菌概述 4 1.3.2 嗜热真菌中的纤维素酶 5 1.3.3 嗜热毛壳菌蛋白表达系统研究进展 5 1.4 多糖单加氧酶研究进展 6 1.4.1 多糖单加氧酶概述 6 1.4.2 多糖单加氧酶表达纯化方法 7 1.4.3 多糖单加氧酶的产物鉴定方法 8 1.5 研究目的与意义 8 2 材料与方法 9 2.1 材料 9 2.1.1 实验菌株与试剂 9 2.1.2 试验试剂、试剂盒和酶 10 2.1.3 试验仪器 10 2.1.4 培养基的配制 11 2. 1.5 溶液的配制 11 2.2 试验方法 11 2.2.1 嗜热毛壳菌DNA 的提取 11 2.2.2 强启动子和PMO 基因的克隆 11 2.2.3 PCR 产物回收 11 I 2.2.4 嗜热毛壳菌表达载体的构建 12 2.2.5 重组表达载体的线性化 12 2.2.6 原生质体的制备及Chaetomium thermophilum 的转化 15 2.2.7 阳性转化子的筛选及验证 21 2.2.8 PMO1 酶的诱导表达 22 2.2.9 PMO1 酶的蛋白分离 22 2.2. 10 Western Blot 验证 23 2.2. 11 PMO1 酶的蛋白纯化 24 2.2. 12 PMO1 酶的性质研究 24 2.2. 12.1 PMO 1 酶的最适反应温度 24 2.2. 12.2 PMO1 酶的最适反应pH …………………………………………………………...24 PMO1 酶的酶解产物构成TLC 分析 24 3 结果与分析 25 3.1 PMO1 基因的序列分析和克隆………………………………………………………….26 3.2 嗜热毛壳菌强启动子的筛选…………………………………………………………….26 3.3 启动子序列的扩增 27 3.4 表达载体的构建 28 3.4.1 表达载体Pactin-PMO1 的构建 28 3.4.2 强启动子重组质粒的构建 29 3.5 嗜热毛壳菌阳性转化子的获得 29 3.6 重组蛋白PMO1 的表达和纯化 30 3.6.1 重组蛋白Ppmo 1-PMO1-Tgpd 的SDS分析………………………………… ...30 3.6.2