陆地棉DNA去甲基化酶（GhDME3）基因的克隆和功能分析.pdfVIP

符 号 说 明 DME: Demeter, DNA 糖基化酶 ROS1: Release of silencing1, 沉默抑制因子1 DML2: Demeter-like2, DNA 糖基化酶类似物2 DML3: Demeter-like 3, DNA 糖基化酶类似物3 MET1: Methyltransferase, 维持DNA 甲基转移酶 CMT: Chromomethylase, 染色质甲基转移酶 DRM: Domains rearranged methyltransferase, 结构域重排甲基转移酶 DNMT: DNA methyltransferase, DNA 甲基转移酶 Gh: Gossypium hirsutum L., 陆地棉 Ga: Gossypium arboretum L., 亚洲棉 Gr: Gossypium raimondii L., 雷蒙德氏棉 At: Arabidopsis thaliana L., 拟南芥 Os: Oryza sativa L., 水稻 Tc: Theobroma cacao L., 可可 PCR: Polymerase chain reaction, 聚合酶链式反应 qRT-PCR: Quantitative real-Time Polymerase Chain, 实时荧光定量PCR EDTA: Ethylenendinitrolotetraacetic Acid, 乙二氨四乙酸 AS: Acetosyringone, 乙酰丁香酮 MES: 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid, 2- （N-吗非啉）乙磺酸 DMSO: Dimethyl sulfoxide, 二甲基亚砜 Kan: Kanamycin, 卡那霉素 Rif: Rifampicin, 利福平 pTRV: Tobacco rattle virus, 烟草脆裂病毒 VIGS: Virus induced gene silencing, 病毒诱导基因沉默 目 录 中文摘要I Abstract III 1 前言 1 1.1 表观遗传学 1 1.1.1 组蛋白修饰 1 1.1.2 非编码RNA 2 1.1.3 DNA 甲基化及去甲基化 2 1.2 DNA 去甲基化 3 1.2.1 被动去甲基化 4 1.2.2 主动去甲基化 4 1.3 DNA 去甲基化的功能 5 1.3.1 DNA 去甲基化在植物生长发育中的作用 5 1.3.2 植物中DNA 去甲基化对胁迫影响 6 1.3.3 棉花逆境胁迫下DNA 甲基化和去甲基化的研究 8 1.4 本研究的目的和意义 8 2 材料与方法 9 2.1 材料与试剂 9 2.1.1 植物材料 9 2.1.2 菌株和质粒 9 2.1.3 抗生素及药品 9 2.1.4 主要试剂 9 2.2 试验方法 10 2.2.1 DNA 去甲基化酶基因家族成员鉴定与分析 10 2.2.2 荧光定量检测相对表达量 11 2.2.3 VIGS 载体构建 13 2.2.4 农杆菌介导的棉花VIGS 实验 19 2.2.5 棉花敲除效率检测 19 2.2.6 盐胁迫和干旱胁迫处理后基因沉默棉花的表型鉴定 20 2.2.7 相关生理指标测定 20 2.2.8 过表达载体构建 22 2.2.9 蘸花法转化拟南芥 24 2.2.10 筛选拟南芥阳性克隆种子 25 2.2.11 转基因拟南芥基因表达分析 25 2.2.12 盐胁迫和干旱胁迫下转基因拟南芥的表型鉴定 27 3 结果与分析 28 3.1 陆地棉DNA 去甲基化酶基因家族成员鉴定 28 3.1.1 陆地棉基因组DNA 去甲基化酶基因鉴定 28 3.1.2 陆地棉DNA 去甲基化酶基因序列分析 30 3.1.3 陆地棉DNA 去甲基化酶基因系统发育树分析 30 3.1.4 陆地棉DNA 去甲基化酶基因转录表达谱分析 31 3.2 陆地棉DNA 去甲基化酶基因表达特性分析 33 3.3 陆地棉GhDME3 基因生物信息学分析 35 3.4 棉花GhDME3 基因的VIGS 植株分子鉴定