链格孢（Alternaria alternata）bHLH转录因子家族基因的克隆及功能研究.pdfVIP

符号说明 Amp: ampicillin, 氨苄青霉素 bp: base pairs, 碱基对 CTAB: cetyl trimethyl ammonium bromide, 十六烷基三甲基溴化铵 ddH O: double distilled H O, 双蒸水 2 2 DEPC: diethyl pyrocarbonate, 焦碳酸二乙酯 dNTP: deoxyribonucleoside triphoshate, 脱氧核糖核苷酸 EB: ethidium bromide, 溴化乙锭 EDTA: ethylene diamine tetrAbcetic acid, 乙二胺四乙酸二钠 GYEB: cetyl trimethyl ammonium bromide, 十六烷基三甲基溴化铵 HPH: hygromycin photransferase, 潮霉素磷酸转移酶 LB: luria-bertani, LB 培养基 PDA: potato dextrose agar, PDA 培养基 PEG: polyethlene glycol, 聚异丙醇 RNase: ribounclease, 核糖核酸酶 RT-PCR: reverse transcriptase polymerase chain reaction, 反转录PCR TE: Tris/EDTA buffer, Tris 缓冲液 Tris: tris droxymethy aminimethane, 三羟甲基氨基甲烷 目 录 中文摘要I AbstractIII 1 引言 1 1.1 烟草赤星病的危害 1 1.2 链格孢菌致病机制2 1.3 转录因子3 1.3.1 bHLH 转录因子基本结构3 1.3.2 bHLH 转录因子调控作用4 1.3.3 bHLH 转录因子家族研究进展5 1.4 研究目的与意义5 2 材料与方法6 2.1 供试材料6 2.1.1 菌株及烟草品种6 2.1.2 细菌菌株及载体6 2.1.3 主要试剂6 2.1.4 主要用酶及试剂盒6 2.1.5 所用仪器和设备6 2.1.6 转化过程所用溶液7 2.1.7 固体培养基的配制7 2.1.8 本试验所用引物序列7 2.2 试验方法 10 2.2.1 bHLH 转录因子家族目的基因的查找及序列分析 10 2.2.2 bHLH 转录因子家族DNA 、RNA 的提取及cDNA 的合成 10 2.2.3 bHLH 转录因子家族基因的克隆 10 2.2.4 Linear minimum element 法构建打靶载体 11 2.2.5 打靶载体的验证 11 2.2.6 质粒提取 12 2.2.7 bHLH 转录因子家族基因重组片段的克隆 12 2.2.8 bHLH 转录因子家族重组片段的凝胶回收 12 2.2.9 原生质体转化 12 2.2.10 bHLH 转录因子家族基因插入突变体的筛选及验证 12 插入突变体的纯化 12 插入突变体的PCR 验证 12 插入突变体的southern 杂交验证 12 2.2.11 4 个基因插入回补体的构建 12 2.2.12 4 个基因插入突变体的生物学表型测定 13 4 个基因插入突变体菌落表型观察及生长测定 13 4 个基因插入突变体菌丝及孢子形态观察 14 4 个基因插入突变体黑色素含量测定 14 4 个基因插入突变体非发酵型碳源利用力分析 14 4 个基因插入突变体毒素毒力测定 14 4 个基因插入突变体致病性分析 15 4 个基因插入突变体胁迫因子敏感性测定 15 3 结果与分析 16 3.1 bHLH 转录因子家族12 个基因的克隆及分析 16 3.1.1 bHLH 转录因子家族12 个基因的克隆 16 3.2 bHLH 转录因子家族12 个基因打靶载体的构建 17 3.3 bHLH 转录因子家族12 个基因插入突变体的筛选和验证 18 3.4 bHLH 转录因子家族4 个基因插入突变体的回补 19 3.5 链格孢4 个bHLH