β-葡萄糖苷酶最适温度、活性和产物耐受性的共定向进化.pdfVIP

摘 要 纤维素在地球上分布广泛，是一种可利用的天然高分子物质。β-葡萄糖苷酶 BGL BGL （ ）是纤维素水解过程中的关键限速酶。目前， 通过理性设计仍然无 法同时提高产物耐受性与其活性。另外，酿酒酵母乙醇发酵温度与BGL 最适温 度差距较大。 本研究以实验室自主筛选的草酸青霉16 中的BGL 为研究对象，从中提取总 RNA BGL cDNA PCR ，通过逆转录手段获得 的 ，再进行 扩增获得了去除信号肽 的16BGL 基因。以16BGL 基因序列为模板，进行了一轮易错PCR，采用七叶 96 苷与柠檬酸铁铵为底物的平板显色法，结合 孔板高通量筛选方法，再通过摇 瓶进行复筛，最终，获得了目的突变体Y-1-B1。 Y-1-B1 50 ℃ 16BGL 20℃ Y-1-B1 40 45 的最适温度为 ，比 低了 。 的比活在 、 、 50和80 ℃分别达到了213.3、405.6、505.3和151.7IU/mg，与16BGL 相比，分 70 % 120 % 80 % 190 % Y-1-B1 k /K 别提高了 、 、 和 。 的催化效率常数 cat m 达到了 -1 -1 1354.94mM S ，其产物抑制强度K /K 值为1.13 （当20mmol/L 葡萄糖时）， appm I 16BGL 1.68 0.89 Y-1-B1 12 % 分别是 的 倍和 倍 （ 葡萄糖的耐受性提高了 ），体 现了更高的产物耐受性和活性。此外，在纤维素的同步糖化和发酵过程中额外添 加Y-1-B1时，它的乙醇产量达到6.85g/L，比16BGL 的乙醇产量提高了22 %。 模型构建及分子对接研究结果表明，Y-1-B1 的突变位点为S414、V421和S441， 这些突变位点远离活性位点口袋，因此推测这些改善的酶学性质与活性位点口袋 无关，这提醒我们不要忽略远离催化中心的其他位点。 总之，本研究通过一轮共定向进化，获得了产物耐受性、活性和最适温度同 时改善的突变体，其在生物乙醇生产上具有潜在的应用价值。 关键词：BGL；产物耐受性；活性；分子对接；生物乙醇；共定向进化 I Abstract Cellulose is widely distributed on the earth and is an available natural high-molecular substance. β-glucosidase (BGL) is a rate-limiting enzyme in the process of cellulose hydrolysis. At present, BGL is still unable to improve product tolerance and activity simultaneously through rational design. In addition, there is a large gap between the optimal temperature of ethanol fermentation of Saccharomyces cerevisiaeandtheoptimal