RT-PCR的实验原理与操作步骤.docx

提取组织或细胞中的总RNA以其中的mRN作为模板，采用Oligo（dT）或随机引 物利用逆转录酶反转录成cDNA再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基 因或检测基因表达。RT-PCF使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA羊品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转 录产物、获取目的基 因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 （一） 反转录酶的选择 Moloney 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活 性相对较弱。最适作用温度为37 C。 禽成髓细胞瘤病毒 （AMV） 反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。 最适作用温度为42 C。 Thermus thermophilus 、 Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录 酶：在Mn2存在下，允许高温反转录 RNA，以消除RNA模板的二级结构。 MMLV 反转录酶的 RNase H- 突变体：商品名为 SuperScript 和 SuperScript U。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一 特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的 m 模板合成较长 cDNA 。 （二） 合成 cDNA 引物的选择 随机六聚体引物： 当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝 其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引