作物青枯病LAMP检测技术规程.pdfVIP

ICS 点击此处添加中国标准文献分类号 DB 江 西 省 地 方 标 准 作物青枯病LAMP 检测技术规程 Techniquely Rules for LAMP Detection on Tuber Crops Bacterial Wilt[Ralstonia solanacearum (Smith)] 江西省市场监督管理局 发 布 DB36/ XXXXX—XXXX 目 次 前言 II 1 1 术语和定义 1 2 样品采集 1 3 样品处理 2 4 LAMP 反应 2 5 LAMP 检测结果判断 2 附录A （资料性附录） LAMP 检测引物、5×LAMP 混合引物配制及反应体系和条件 3 I 前 言 II DB36/ XXXXX—XXXX 作物青枯病LAMP 检测技术规程 范围 本标准规定了马铃薯、甘薯、芝麻、花生、烟草及茄科蔬菜等作物青枯病（bacterial wilt ）的LAMP 检测技术。 本标准适用于马铃薯、甘薯、芝麻、花生、烟草及茄科蔬菜等作物青枯病LAMP检测。 1 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 1.1 LAMP扩增技术 Loop-mediated isothermal amplification 环介导等温扩增技术（简称LAMP扩增技术）是一种可于特定恒温条件下，实现短时间内对靶标序 列高效扩增的技术。检测结果通过肉眼观察绿色荧光的生成进行判断。该技术具有“简便、快速、精确、 低价”的特点。已广泛用于病害的诊断及病原菌的定性定量检测。 1.2 引物 primer 指一小段单链DNA 或RNA ，作为DNA 复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链 进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。 1.3 反应体系 LAMP反应体系主要要素为：外引物、内引物、dNTP 、Bst 2.0 DNA聚合酶、10×Thermo Pol buffer 缓冲液、MgSO 、Mncl 、甜菜碱、模板和钙黄绿素。在恒温条件下，Bst 2.0 DNA聚合酶通过链置换催 4 2 化靶基因片段合成；而反应体系中的染料与Mn2+结合发生颜色变化，达到可视化目的。 2 样品采集 将新鲜的疑似病株用吸水纸包好，整株带回实验室，保存于4℃冰箱，备用。 1 DB36/ XXXXX—XXXX 3 样品处理 截取适量待检测样品，悬浮于装有适量无菌水的试管中并剪碎，静置30 min ；或加适量无菌水研磨， 静置5 min ，取上清液。以悬浮液或上清液为模板，以无菌水为空白对照，进行LAMP检测。 4 LAMP 反应 以提取的疑似作物病株样品组织悬浮液或上清液为模板，以模式菌株GMI1000菌悬液为阳性模板， 以无菌水为阴性模板，采用特异性引物 （附件A ）对待测样品进行LAMP检测。扩增反应在25