分子生物学研究方法DNNA蛋白质相互作用.pptVIP

西北师范大学 第五章分子生物学研究的主要方法 生命科学院分子生物学 返回目录 返回第二章 第六节研究DNA与蛋白质相互作用的方法 2.6.1凝胶阻滞试验 原理 又叫做DNA迁移率变动试验,是80年代初出现的用于在体外研究DNA与 蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。简单、快捷,是当前被选 作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法 在凝胶电泳中,由于电场的作用,裸露的DNA朝正电极移动的距离是同 其分子量的对数成反比,如果DNA分子结合上一种蛋白质,那么由于分 子量加大,在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞,朝正电极移动的距离也 就相在缩短了。所以当特定的DNA片段同细胞提取物混合之后,若其在 凝胶电泳中的移动距离变小了,这就说明它已同提取物中的某种特殊蛋 白质分子发生了结合作用。  西北师范大学 第五章分子生物学研究的主要方法 生命科学院分子生物学 凝胶阻滞试验方法 首先是用放射性同位素标记待检测的DNA片段(亦称探针DNA),然后同 细胞蛋白质提取物一道温育,于是便有可能形成DNA一蛋白质复合物。将 它加样到非变性的凝胶中,在控制使蛋白质仍与DNA保持结合状态的条件 下进行电泳分离,并应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位 置。如果细胞层白质提取物中不存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋 白质,那么所有放射性标己都将集中出现在凝胶的底部;反之,将会形成 DNA一蛋白质复合物,由于凝胶阻滞的缘故,其特有的放射性标记的探针 DNA条带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。所以有的文献中也称这 种试验为条带阻滞试验( band retardation assay)。  西北师范大学 第五章分子生物学研究的主要方法 生命科学院分子生物学 性标记的NA 质与DNA結合 放射M 沔芒姦鸚容^ 凝胶阻滞试验的本理图 放射性标记的DA由子同 电家中籹动速变馒,在放射白屈影现滞后的  西北师范大学 第五章分子生物学研究的主要方法 生命科学院分子生物学 凝胶阻滞试验用途 鉴定特殊细胞提取物中,是否存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白 质分子(比如特异的转录因子等) 研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性:其办法是在DNA 蛋白质结合反应体系中,加入超量的非标记竞争DNA。如果竞争同一种蛋 白,由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的,绝大部分蛋白质都会 被其竞争结合掉而使探针DNA处于自由状态,自显影图片上不出现阻滞的 条带,相反,如果不竞争同一蛋白,探针DNA仍与特定蛋白复合,呈现阻 滞的条带。 使用竞争DNA,可间接阐明体内的DNA与蛋白质的相互作用。如,使用 种具有与已知转录因子结合位点的竞争DNA,就可以判断检测到的蛋白 质是否属于此类转录因子,或是与之相关的其它转录因子;如果事先引入 突变,可以检测突变对其与转录因子结合作用的影响  西北师(a) 法 米二二*三三 白质与本 放射自显 图2-42 滞实验中竞争DNA与探针DNA之间的竞争作用 (a)没有力 的正常的凝胶阻滞实验,探针DNA与特异蛋白质结合,出现 且带条带; 量竞争DNA与探针DNA竞争结合同一种蛋臼质,阻滞条带 针DNA分划结合不同的蛋白质,出现同(a)一样的阻滞条件  西北师范大学 第五章分子生物学研究的主要方法 生命科学院分子生物学 2.6.2 DNase l足迹试验 尽管凝胶阻滞试验能够揭示出在体内发生的DNA蛋白质之间 相互作用的有关信息,然而它却无法确定两者结合的准确部 位。要解答这个问题,则需要应用 DNasel足迹试验 ( footprinting assay)。它是一类用于检测与特定蛋白质结合 的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。  西北师范大学 第五章分子生物学研究的主要方法 生命科学院分子生物学 DNasel足迹试验过程 口首先是将待检测的双链DNA分子用3P作末端标记,并用限制酶去掉其 中的一个末端,得到只一条链单末端标记的双链DNA分子 口体外同细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后,再加入少量的 DNasel(它可沿着靶DNA作随机单链切割)消化DNA分子,并控制酶的 用量使之达到平均每条链只发生一次磷酸二脂键的断裂。如果蛋白质提取 物中不存在与DNA结合的特异蛋白质,经 DNasel消化之后便会产生出距 放射性标记末端1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸等一系列前后长度均 仅相差一个核苷酸的、不间断的、连续的DNA片段梯度群体。  西北师范大学 第五章分子生物学研究的主要方法 生命科学院分子生物学 口从此混合物中除去蛋白质之后