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在测定维生素C 的国标方法中,荧光法为测定食物中维生素C 含量的第一标准方法,2,4 －二硝基苯肼法作为 第二法. 一,荧光法 1.原理 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后,与邻苯二胺（OPDA ）反应生成具有荧光的喹喔 啉（quinoxaline ）,其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比, 以此测定食物中抗坏血酸和脱氢 抗坏血酸的总量. 脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与 OPDA 反应, 以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰.本方法的最 小检出限为0.022 g/ml. 2.适用范围 GB12392-90 本方法适用于蔬菜,水果及其制品中总抗坏血酸的测定 3.仪器 3.1.实验室常用设备. 3.2.荧光分光光度计或具有350nm 及430nm 波长的荧光计. 3.3.打碎机. 4.试剂 本实验用水均为蒸馏水,试剂不加说明均为分析纯试剂. （1）偏磷酸－乙酸液：称取15g 偏磷酸,加入40m 冰乙酸及250m 水,搅拌,放置过夜使之逐渐溶解,加水至 500ml.4 ℃冰箱可保存7～10 天. （2 ）0.15 mol/L 硫酸：取10m 硫酸,小心加入水中,再加水稀释至1200ml. （3 ）偏磷酸－乙酸－硫酸液：以0.15mol/L 硫酸液为稀释液,其余同4.1.配制. （4 ）50 ％ 乙酸钠溶液：称取500g 乙酸钠（CH3COONa·3H2O ）,加水至1000ml. （5 ）硼酸-乙酸钠溶液：称取3g 硼酸,溶于100m 乙酸钠溶液（4.4 ）中.临用前配制. （6 ） 邻苯二胺溶液：称取20mg 邻苯二胺,于临用前用水稀释至100ml. （7 ） 0.04%百里酚蓝指示剂溶液：称取0.1g 百里酚蓝,加0.02mol/L 氢氧化钠溶液,在玻璃研钵中研磨至溶 解,氢氧化钠的用量约为10.75ml,磨溶后用水稀释至250ml. 变色范围：pH=1.2 红色 pH=2.8 黄色 pH ＞4.0 兰色 （8 ） 活性炭的活化：加200g 炭粉于1L 1+9 盐酸中,加热回流1~2h,过滤,用水洗至滤液中无铁离子为止,置 于110~120℃烘箱中干燥,备用. （9 ）标准 抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）：准确称取50mg 抗坏血酸,用溶液（4.1 ）溶于50ml 容量瓶中,并稀释至刻度. 抗坏血酸标准使用液（100μg/ml）: 取10ml 抗坏血酸标准液,用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml.定容前试pH 值,如其pH ＞2.2 时,则应用溶液（4.3 ）稀释. 标准曲线的制备：取下述标准溶液（抗坏血酸含量 10μg/ml）0.5,1.0,1.5 和2.0ml 标准系 ,取双份分别置 于10ml 带盖试管中,再用水补充至2.0ml. 5.操作步骤 5.1 样品制备 全部实验过程应避光. 称取100g 鲜样,加100g 偏磷酸-乙酸溶液,倒入打碎机内打成匀浆,用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度.如呈红 色,即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释,若呈黄色或兰色,则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释,使其pH 为1.2.匀浆的取量 需根据样品中抗坏血酸的含量而定.当样品液含量在40~100μg/ml之间,一般取20g 匀浆,用偏磷酸-乙酸溶液 稀释至100ml,过滤,滤液备用. 5.2 氧化处理：分别取样品滤液及标准使用液各 100ml 于带盖三角瓶中,加 2g 活性炭,用力振摇 1min,过滤, 弃去最初数毫升滤液,分别收集其余全部滤液,即样品氧化液和标准氧化液,待测定. 5.3 各取5ml 标准氧化液于2 个50ml 容量瓶中,分别标明标准及标准空白. 5.4 各取5ml 样品氧化液于2 个50ml 容量瓶中,分别标明样品及样品空白. 5.5 于标准空白及样品空白溶液中各加5ml 硼酸-乙酸钠溶液,混合摇动15min,用水稀释至50ml,在4 ℃冰 箱中放置2h,取出备用. 5.6 于样品及标准溶液中各加入5ml50% 乙酸钠溶液,用水稀释至50ml,备用. 5.7 荧光反应 取标准空白溶液,样品空白溶液及（5.6 ）中样品溶液各 2ml,分别置于 10ml 带盖试管中.在暗室中迅速 向各管中加入5ml 邻苯二胺,振摇混合,在室温下反应35min,用激发光波长338nm,发射光波长420nm 测定荧 光强度.标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标,对应的抗坏血酸含量为横坐标,绘制标准曲 线或进行相关计算,其直线回归方程供计算时使用. 6. 计算 X= （c×V/m ）×F×(100/1000) 式中：X样品中抗坏血酸