细胞贴片免疫组化染色步骤.pptVIP

亲和免疫组化技术 (Affinity cytochemistry histochemistry technique) 亲和的概念 物质之间具有的高度结合力,包括抗原与抗体 生物素与抗生物素(又称亲和素)、葡萄球菌A蛋白 与lgG、植物凝集素与糖类、阳离子与阴离子、激素 与受体之间的结合反应等 第“节生物素一亲和素免疫细胞化学技术 基本原理 (一)生物素( Biotin)与亲和素卵白素抗生物素 ( Avidin/anti-Botn)之间有很强的亲和力 二)生物素和亲和素具有与其它示踪物质如荧光素和过 氧化物酶等相结合的能力 种经典的抗生物素一生物素染色法 )ABc( Avidin Biotin- peroxidase Complex)技术 (二)LAB( Labelled Avidin- Biotin)技术 (=) LSAB(labeled streptavidin biotin method): SP( streptavidin- peroxidase)技术 SABc( streptavidin- biotin complex)技术 (四)BRAB( Bridged Avidin- Biotin)技术 (五)cSA( Catalyzed signal amplification)法 (六) Envision技术 C亲和素生物素过氧化物酶 ( Avidin Biotin-peroxidase Complex,ABC)技术 1.基本原理 标生物紫多 生物素化二抗 一抗 ABC法示意圈 2、操作步骤 (1)石蜡切片常规脱蜡至水,冰冻切片经冷丙酮固定,用PBS洗; (2)用3%H202甲醇液室温作用20min后,充分水洗 (3)PBS洗,加牛血清白蛋白或二抗动物种属正常血清15min (4)加第一抗体(即用型或浓缩型)4℃过夜或37℃1h; (5)PBs洗,加生物素化第二抗体37℃30min; (6)PBS洗,加ABC复合物(1:100,使用前30mn将等量的亲和素 和酶标生物素混合,稀释配制成ABC复合物),37℃20mn (7)PBS洗,经DABH22显色 (8)常规脱水,透明,中性树胶封固。 3、ABC法的优点 (1)敏感性高:结合力强,分子量小 (2)特异性强,背景染色淡; (3)方法简便,节约时间 (4)由于生物素与抗生物素具有与多种标记物结合的能力,可用于 双重或多重免疫染色。 标泡生物素抗生物素技术 ( Labelled Avidin- Biotin Technique,LAB技术) 基本原理 以生物素标 记抗体作第一抗 体,酶标记抗生 物素作为第二抗 体,同SP技术 Figure 11: In the LAB or LSAB tchnology, the enzymeLabelled streptavidin reacts witn the biounyated secondary andbody LAB法示意图 2、操作步骤 (1)①④步骤与ABC法相同; (5)PBS洗后加生物素标记第一抗体37℃3min (6)PBS洗后加酶标亲和素(如 HRP-Avidin)37℃30min: (7)以下步骤同ABC法。 三LsAB( labeled streptavidin biotin)技术: SP( streptavidin- peroxidase)技术 SABC( streptavidin- biotin complex)技术 、基本原理 Ag Ag P方法示意图 SABC示意图