酶分离纯化过程中需要注意什么问题？为什么进行酶活力酶比活力测定精选.pptVIP

酶的分离与纯化 P制作8明 p88导聪 线防感  酶的分离与纯化 醢在分离纯化中应注意的问题 酶活力 酶比活力 录 酶活回收率 醃比活力提高比  酶的提取、分离纯化技术路线 细胞破碎·动物、植物或微生物细胞 酶提取 酶分离纯化 酶浓缩 离心分离,过滤分离,沉淀分 酶贮存 离,层析分离,电泳分离,萃 取分离,结晶分离等。  根据酶提取时,所釆用的溶剂或溶液的不同,酶抽提的方法主要 有盐溶液提取,酸溶液提取,碱溶液提取,有机溶剂提取等。 1.盐溶液提取: 大多数酶在一定浓度的盐存在条件下,酶的溶解度增加 即盐溶,但盐浓度不能太高,否则溶解度反而降低,即盐析 故:一般采用稀盐溶液进行酶的提取,盐浓度控制在0.02 0.5mo1/L。如淀粉酶、蛋白酶等胞外酶0.14mol/1氯化钠溶液提 取 2.酸溶液提取: 有些酶在酸性条件下溶解度比较大,且稳定性好,宜用 酸溶液提取。提取时需注意溶液的p不能太低,以免酶变性失活。 如胰蛋白酶可用0.12mo1/1硫酸溶液提取。  3碱性溶液提取 有些酶在碱性条件下溶解度较大,且稳定性较好,宜用碱 溶液提取,操作时注意pH不能过高,以免影响酶活,同时加 碱液时要—边搅拌—边缓慢加进,避免局部过碱而引起酶变 性失活。 4有机溶剂提取 有些酶与脂类物质结合牢固或含有较多非极性基团,可采 用与水可以混溶的乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂提取。  影响酶分离纯化的主要因素 1.温度: 提取时的温度对酶的提取效果有明显影响,一般来说, 适当提高温度,可提高酶的溶解度,但温度过高则容易引起酶 的变性失活,所以提取时温度不宜过高,特别是采用有机溶剂 提取时,温度应控制在0°10℃的低温条件下。 2. pH 溶液的pH对酶的溶解度和稳定性有显著影响,在达到酶等 电点时的p值下,酶分子的溶解度最小。为了提高酶的溶解度, 提取时p应避开酶的等电点以提高酶的溶解度。  3.提取液的体积: 增加提取液的用量,可以提高酶的提取率,但是过量 的提取液会使酶的浓度降低,对进一步的分离纯化不利。所 以提取液的总量一般为原材料的35倍,最好分多次提取。 4.添加保护剂: 加入适量的酶作用底物、辅酶或抗氧化剂可以提高酶 稳定性,减少酶活损失。  酶活力 酶活力也称为酶活性,是指酶催化一定化学反应的能力 酶活力的大小可用在一定条件下,酶催化某一化学反应的速 度来表示,酶催化反应速度愈大,酶活力愈高,反之活力愈 低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速 度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加 量来表示。一般以产物增量来表示酶促反应速度。 1个酶活力单位是指在特定条件下,在1分钟内能转化1微 摩尔底物的酶量,或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。  酶活力的测定方法 终点法 测定完成一定量反应所需的时间,如α-淀粉酶的活力测定 因为碘对淀粉呈现蓝色反应,当淀粉溶液中加入淀粉酶后,碘 的蓝色反应消失而呈现红棕色;碘对淀粉颜色反应消失的时间 可表示淀粉酶活力的大小。 2.动力学方法 测定一定时间内所起的化学反应量。 ①比色法如果酶反应的产物可与特定的化学试剂反应而生成 稳定的有色溶液,且生成颜色的深浅与产物的浓度在一定的范 围内有线性关系可用此法。 ②量气法主要用于有气体产生的酶促反应。如氨基酸脱羧酶 脲酶的活力测定。产生的二氧化碳量可用特制的仪器如瓦氏呼 吸仪测定之。根据气体变化和时间的关系,即可求得酶反应的 速度。  ③滴定法如果产物之一是自由的酸性物质可用此法。如脂肪酶 催化脂肪水解,脂肪酸的增加量代表脂肪酶的活力。 ④分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同,可直接测定 反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。几乎所有的氧化 还原酶都使用该法测定。 ⑤放射测量法是酶活力测定中较常用的一种方法。一般用放射 性同位素标记底物,在反应进行到一定程度时,分离带放射性 同位素标记的产物并进行测定,就可测知反应进行的速度。