基础生物学实验三基础生物学实验安徽大学生物研究生复试生命科学学院.ppt

（五） 透明 将 脱 色吹 干 后的 薄 膜浸 入 透明 甲 液中 2 min ，取出立即放入透明乙液中浸泡 1 min ，取 出后立即紧贴于干净玻璃板上，两者间不能有 气泡。 5 ～ 10 min 薄膜完全透明。若透明太慢可 用透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次，垂直放 置，待其自然干燥或用吹风机冷风吹干且 无酸 味 ，再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗，当 薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角， 用手轻轻将透明的薄膜取下，用滤纸吸干所有 的水分，压干。此薄膜透明，区带着色清晰， 可用于光吸收计扫描。长期保存不褪色。 五、实验建议 (1) 醋酸纤维素薄膜的预处理 市售醋酸纤维素薄膜 均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之 一。为防止指纹污染，取膜时应戴指套或用夹子。所 选薄膜应厚薄均匀，否则应弃去不用，以免造成电泳 区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。 由于薄膜吸水性比纸小，浸泡 30 min 以上是保证膜片 上有一定量缓冲液，并使其恢复到原来多孔的网状结 构，最好让薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将膜 片上聚集的小泡赶走。点样时薄膜上的缓冲液不宜太 多，但也不能太干。 (2) 缓冲液的选择 本实验常用的 pH8 ． 6 巴比妥缓冲 液，其浓度为 0 ． 05 ～ O ． 09 mol ／ L 。选用何种浓度与 样品及薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，则区带泳 动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区 带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。 (3) 加样量 加样品量的多少与电泳条件、样品性质、 染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原则， 检测方法越灵敏，加样量越少，对分离更有利。如加 样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至相互干扰， 染色也较费时。 点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印 章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将 薄膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。 (4) 电量选择 电泳过程应选用合适的电流强度，一 般为 0.3 ～ 0 ． 5 mA ／ cm 宽膜。电流强度高，则热效应 高，可能引起蛋白质变性或由于缓冲液蒸发造成膜片 干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。 (5) 染色液的选择 染色液应根据样品的特点加以选 择。其原则是染料对被分离样品有强的着色力，背景 易脱色，应尽量采用水溶性染料，不宜选择醇溶性染 料，以免使薄膜溶解。 应控制染色时间。时间太长，薄膜底色深不易 脱去；时间太短，着色浅不易区分，或造成染 色不均匀，必要时可进行复染。 (6) 透明及保存 透明液应临用前配制，以免 冰乙酸和乙醇挥发而影响透明效果。这些试剂 最好选用分析纯。透明前薄膜应完全干燥。透 明时间应掌握好。如在透明乙液中浸泡时间太 长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。 透明后的薄膜完全干燥后才能浸入液体石 蜡中，使薄膜软化。如有水，则液体石蜡不易 浸入，薄膜不易展平。 ? 六、实验报告及作业 ? 1 ．根据人血清中血清蛋白各组分等电点， 如何估计它们在 pH8 ． 6 的巴比妥一巴比妥钠电 极缓冲液中移动的相对位置 ? ? 2. 简述醋酸纤维素薄膜电泳原理及优点。 ? 3. 绘出酸纤维素薄膜电泳结果。 ? 4. 造成电泳图谱不整齐的原因有哪些？ 实验四 酵母 RNA 的提取及含量测定 一、 实验目的 1. 掌握 RNA 提取的原理及方法。 2. 学会使用地衣酚法测定 RNA 的含量。 二、 实验原理 一般的生物细胞中同时含有 DNA 和 RNA ，在酵母 中 RNA 比 DNA 的含量高得多， DNA 则少于 2 ％ (O ． 03 ％～ O ． 516 ％ ) ，故在实验室常用酵母作为 RNA 提取 的材料。若要制备具有生物活性的 RNA ，常用苯酚 法；若对生物活性没有要求，则可使用浓盐法，稀 碱法等。 从化学组成来说， RNA 由碱基、磷酸和戊糖组成。 在酸性条件下，戊糖转化成糠醛，其可与地衣酚生成绿 色复合物，反应如下： 这种复合物在 670 nm 波长处有最大光吸收。当 RNA 的 浓度于 10 ～ 100u g ／ ml 范围内，其浓度与光密度值成线 性关系。样品中少量脱氧核糖核酸 (DNA) 存在对测定无干 扰，蛋白质、粘多糖也干扰测定。 本实验采用的稀碱，既可加速细胞的 破裂，又可增大 RNA 的溶解度。当碱被