高中生物第五章 第三节 血红蛋白的提取和分离课件 新人教版选修.pptVIP

本课题学习目标 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并 了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。 1 、主要概念： ① 凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④它们在血 红蛋白的提取中分别起到什么作用。 2. 主要原理： ①凝胶色谱法分离蛋白质的原理 ②电泳法分离样品的原理 ③缓冲溶液的组成和作用机理 3 、课题重点： 凝胶色谱法的原理和方法 4 、 课题难点： ①样品的处理 ②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。 1. 分离生物大分子的基本思路： 选用一定的 物理或化学 的方法分离具有不同物 理或化学性质的 生物大分子 。 2. 蛋白质分离和提取的原理： 根据蛋白质 各种特性 的差异，如 分子的形状和 大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质 和对其他分子的亲和力 等等，可以用来分离 不同种 类的蛋白质。 一、血红蛋白的提取和分离 3 、提取分离方法 凝胶色谱法 凝胶电泳法 （一） 凝胶色谱法（ 分配色谱法 ） 2. 凝胶： 大多数凝胶是由 多糖类化合物 （如葡聚糖或琼脂 糖）构成的多孔小球体 ， 内部有许多贯穿的 通道。 根据被分离物质的 蛋白质相对分子质量的 大小， 利用具有网状结构的凝胶，来进行分 离。 1. 概念： 3. 凝胶色谱法的原理 ①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时， 相对 分子量较小的蛋白质 容易 进入凝胶内部的通道， 路程较长，移动速度较慢 ; ②相对分子量 较大 的蛋白质 无法进入凝胶内部的 通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速 度较快。 ③ 依据的特性是： 蛋白质分子量的大小。 4. 凝胶色谱法 分离蛋白质 的原理和 具体过程 凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示 （二）缓冲溶液 1. 概念 : 在一定的范围内，凡是能够抵制 外加少量强 酸或强碱 的影响使原来溶液 PH 值基本保持 不变的混 合溶液。 能够抵制外界的酸和碱对溶液 PH 值的影响， 维持 PH 基本不变。 2. 作用 : 思考：说出人体血液中缓冲对。 NaH 2 PO 4 /Na 2 HPO 4 H 2 CO 3 /NaHCO 3 通常由 1 － 2 种缓冲剂 溶解于水中配制而成。调节缓 冲剂的 使用比例 就可以制得在 不同 PH 范围内使用的缓 冲液。 4. 提问：在本课题中使用的缓冲液是 :__________ , 利用缓冲液 模拟细胞内的 PH 环境 ，保证 血红蛋白的正常结构和功能 ，便于观察 ( 红色 ) 和科 学研究 ( 活性 ) 磷酸缓冲液 3. 缓冲溶液的配制 : 其目的是 : （三） 电泳： 1. 概念： 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2. 原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有 可解离的基团，在 一定的 PH 下，这些基团会带上 正 电或负电。 ②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带 电荷 相反 的电极移动。 ③分离样品中各种分子 带电性质的差异以及分子本 身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁 移速度， 从而实现样品中各种分子的分离。 影响蛋白质分子运动速度的因素 决定 运动方向 形成 库仑力 形成 阻力 决定 运动速率 电荷性质 电荷量 分子形状 分子大小 √ √ √ √ √ √ √ 3. 类型 : 琼脂糖 凝胶电泳、 聚丙稀酰胺 凝胶电泳。 在 电场 的作用下， 这 些 带电 分子 会 向着 与 其所 带电 荷相 反的 电极 移 动 琼脂糖凝胶电泳示意图 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 、测定蛋白质分子量 : 常用 十二烷基硫酸钠 （ SDS ）—聚丙烯酰胺 凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是由 单体丙烯酰胺 和 交联剂N,N - 亚 甲基双丙烯酰胺 在 引发剂 和 催化剂 的作用下聚合交联成的 具有三维网状结构的凝胶。 N,N - 亚甲基双丙烯酰胺（形成交联） 丙烯酰胺和交联剂 N,N - 亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的 迁移率 取决 于它所带 净电荷的多少 以及 分子的大小 等因素。 2. 原理： SDS 能使 蛋白质发生完全变性。解聚成单条肽 链 ，因此测定的结果只是 单条肽链的分子量 。 SDS 能与各种蛋白质形成 蛋白质— SDS 复合物 ， SDS 所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子 原有 的电荷量 。因而 掩盖了不同种蛋白质间的电荷差 别， 使 电泳迁移率完全取决于分子的大小。 3. SDS 作用机理 : 用 SDS 测定蛋白质分子量的方法 使用 SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳 测定蛋 白质的分子量时，可选用一组 已知分子量 的标准蛋白 同时进行电泳，根据已知分子 量的标准蛋白的 电泳区带位置 ，可以测定 未知蛋白质 的分子量。 市场上有高分子量、 次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出 售。 二、实验操作 样品处理→粗分离 → 纯