试验四目基因PCR扩增的及扩增产物回收.pptVIP

聚合酶链式反应(P0R)扩增DNA片段 1实验目的和要求 学习和掌握PCR基因扩增的原理和操 作方法,并深刻理解PCR基因扩增技 术在DNA操作中的重要性。本实验以 含有小鼠的基因(暂定T10)的质粒 pCMV-Mye-T10为模板,扩增出约 800bp的产物。 2.相关基础知识 )多聚酶链式反应 Polymerase Chain Reaction, PCR):是一种对特定的DNA片段在体外进行快速 扩增的方法。 1985年 Kary mullis及同事创立。随后借助于热稳 定性 Taq dna聚合酶的发现(1976年Chen等分离 的热稳定性 Tag dna聚合酶),使PCR自动化成 为可能;1987年 Kary mullis:等完成了自动化操作 装置,使PCR技术进行实用阶段。1993年度 Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得 诺贝尔化学奖 3 PCR的特点及应用: PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和 量要求低。因此,广泛应用于许多领域。 1.基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外 获得突变体、提供大量DNA用于测序等; 2.遗传病的产前诊断; 3.致病病原体的检测 4.癌基因的检测和诊断; 5.DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证; 6.动、植物检疫; 7.在转基因动植物中检查植入基因的存在。 原理类似于DNA的变性和复性过程,即在高温(93-95℃ )下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA 模板;而后在低温(37~65℃)情况下,两条人工合成 的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分 双链;在Taq酶的最适温度(72℃)下,以引物3端为合 成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5’→3方向延 伸,合成DNA新链。这样,每一双链的DNA模板,经过 次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条 双链DNA分子。如此反复进行,每一次循环所产生的 DNA均能成为下一次循环的模板,每一次循环都使两条 人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍,PCR 产物得以2的批数形式迅速扩增,经过25~30个循环后 理论上可使基因扩增10倍以上,实际上一般可达10° 07倍 2)PCR反应系统的组成 PcR反应系统的组成主要包括: 引物、寡核苷酸、7 ag dNA聚合酶、 模板DNA、缓冲液。 引物: 要扩增模板DNA,首先要设计两条寡核 苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶 DNA序列互补的寡核苷酸片段,两引物 间距离决定扩增片段的长度,两引物的 5端决定扩增产物的两个5’末端位置。 由于引物是决定PR扩增片段长度、位 置和结果的关键,因此,引物设计也 就更为重要。 引物的设计: 1.长度一般最低不少于16个核苷酸,而最高不超过 30个核苷酸,最佳长度为20~24个核苷酸。有时 可在5端添加不与模板互补的序列,如限制性酶 切位点或增强因子等,以完成基因克隆和其它特 殊需要,但要在酶切位点的5端加上额外的3-4 个核苷酸,以确保附加的酶切位点有效。 2.两个引物之间不应发生互补,特别是在引物3端, 即使无法避免,其3端互补碱基也不应大于2个碱 基,否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体” (Primer dimer 3.(G+G)%含量引物的组成应均匀,尽量避免含有相 同的碱基多聚体。两个引物中(G+c)%含量应尽 量相似。 4.引物内部应避免内部形成明显的次级结构,尤其 是发夹结构( hairpin structures) 9 引物在PQR反应中的浓度一般在0.1~ 1μM之间。浓度过高易形成引物二聚体 且产生非特异性产物。一般来说用低浓 度引物经济、特异,但浓度过低,不足 以完成30个循环的扩增反应,则会降低 PCR的产率。 引物退火温度决定PCR特异性与产量;温度高特异 性强,但过高则引物不能与模板牢固结合,DNA扩 增效率下降;温度低产量高,但过低可造成引物 与模板错配,非特异性产物增加。一般可根据引 物的(G+)%含量进行推测,一般实验中退火温 度Ta( anneal ing temperature)比扩增引物的融 解温度Tm( melting temperature)低5℃,可按公 式进行粗略计算: Ta=Tm-5C=4(G+C)+2(A+T)-5c(例) 其中A,T,G,O分别表示相应碱基的个数。在典 型的引物浓度时(如0.2μmo/L),退火反应数秒 即可完成。 11