PCR常见问题及解决方案精品课件.pptVIP

* 基因组扩增（较高灵敏度和特异性） PCR常见问题、原因分析及其对策 PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案 提高PCR反应特异性的策略 主讲内容 PCR技术简介 PCR标准反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 dNTP ddH2O 耐热聚合酶 反应体系对PCR扩增的影响 DNA模板 纯度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓度 加量过多导致非特异性扩增增加 特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体 完整性 避免反复冻融 浓度 应适当,过高导致非特异性增加,过低则 引 物 扩增产物太少 反应体系对PCR扩增的影响 反应Buffer pH值,盐离子浓度 稳定剂,增强剂 Mg 2＋浓度 过高非特异性严重 过低无扩增产物 dNTP Mixture 浓度适当 避免反复冻融 ddH2O pH值适当 避免污染 PCR标准反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg 2＋ dNTP ddH2O 耐热聚合酶 如何选择最合适的DNA聚合酶 DNA 聚合酶的特性 PCR 实验的不同需求 如何选择最合适的DNA聚合酶 －－ DNA 聚合酶的特性 纯 度 稳定性 酶活性 如何选择最合适的DNA聚合酶 －－ PCR 实验的不同需求 长片段扩增 PCR试剂盒 扩增效率 保 真 性 特 异 性 基因组扩增、RT-PCR 基因筛选、测序、 基因克隆 复杂模板扩增（GC含量高、二级结构） 构建基因图谱、测序、分子遗传学 复杂模板扩增、大规模基因检测 特异性 － 热启动 Taq酶 原 理 蜡封 抗体抑制 化学修饰 特 点 避免非特异性扩增 提高PCR反应的 特异性 用 途 基因组扩增 RT-PCR － 热启动 Taq酶 特异性 产 品 类 型 产 品 名 称 产 品 性 能 化学修饰 天为时代: HotStart Taq Roche : FastStart Taq Abgene: Thermo-start? DNA Polymerase Stratagene: SureStart? Taq 大大提高PCR反应的特异性 化学修饰不影响后续实验 抗体抑制 Invitrogen： AccuPrimeTM Taq Platinum? Taq TaKaRa： ExTaqTM HotStart Version 蜡封 Promega：TaqBeadTM?HotStart 保真性 — 高保真酶 原 理 用 途 3’－5’核酸 表达基因的克隆 基因的定点突变 细胞内基因点突变分析（SNP） 外切酶活性 降低碱基错配率 保真性 — 高保真酶 产 品 类 型 生 物 公 司 性 能 比 较 Pfu DNA Polymerase 天为时代 Stratagene Promega 在目前已发现的所有耐热聚合酶中, Pfu保真度最高碱基错配率最低 PyrobestTM DNA Polymerase TaKaRa Tli DNA Polymerase Promega 高保真 ＋ 高扩增效率 原 理 混合酶 －高扩增效率 － 3’－5’核酸外切 用 途 超长片段扩增 －测序 －构建基因图谱 复杂模板扩增 －GC含量高 －二级结构 高保真 ＋ 高扩增效率 特 点 产 品 性 能 高扩增效率 天为时代：Taq Plus TaKaRa：Ex TaqTM 复杂模板扩增 高保真 天为时代： Taq Platinum Invitrogen：Pfx Platinum Taq High Fidelity 保真度低于Pfu聚合酶 但扩增效率较高 长片段扩增 天为时代：Long Taq TaKaRa：LA Taq Invitrogen：Elongase Amplificaiton System 特别适用于保真度较高的 超长片段扩增 PCR MasterMix 原 理 预配好的PCR反应液 DNA聚合酶