在测定维生素C的国标方法中.docVIP

在测定维生素 C 的国标方法中 ,荧光法为测定 食物 中维生素 C含量的第一标准方法 ,2,4－二硝基苯肼法作为 第二法 . 一,荧光法 1.原理 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后 ,与邻苯二胺（ OPDA ）反应生成具有荧光的喹喔 啉（quinoxaline ）,其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比 ,以此测定食物中抗坏血酸和脱氢 抗坏血酸的总量 . 脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与 OPDA 反应,以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰 .本方法的最 小检出限为 0.022 g/ml. 2.适用范围 GB12392-90 本方法适用于蔬菜 ,水果及其制品中总抗坏血酸的测定 3.仪器 3.1.实验室常用设备 . 3.2.荧光分光光度计或具有 350nm 及 430nm 波长的荧光计 . 3.3.打碎机 . 4.试剂 本实验用水均为蒸馏水 ,试剂不加说明均为分析纯试剂 . （1）偏磷酸－乙酸液：称取 15g 偏磷酸 ,加入 40ml 冰乙酸及 250ml 水,搅拌,放置过夜使之逐渐溶解 ,加水至 500ml.4℃冰箱可保存 7～10 天. （2）0.15 mol/L 硫酸：取 10ml 硫酸,小心加入水中 ,再加水稀释至 1200ml. （3）偏磷酸－乙酸－硫酸液：以 0.15mol/L 硫酸液为稀释液 ,其余同 4.1.配制. （4）50％ 乙酸钠溶液：称取 500g 乙酸钠（ CH3COO·Na 3H2O）,加水至 1000ml. （5）硼酸 -乙酸钠溶液：称取 3g 硼酸,溶于 100ml 乙酸钠溶液（ 4.4）中.临用前配制 . （6） 邻苯二胺溶液：称取 20mg 邻苯二胺 ,于临用前用水稀释至 100ml. （7） 0.04%百里酚蓝指示剂溶液：称取 0.1g 百里酚蓝 ,加 0.02mol/L 氢氧化钠溶液 ,在玻璃研钵中研磨至溶 解,氢氧化钠的用量约为 10.75ml,磨溶后用水稀释至 250ml. 变色范围： pH=1.2 红色 pH=2.8 黄色 pH＞4.0 兰色 （8） 活性炭的活化：加 200g 炭粉于 1L 1+9 盐酸中 ,加热回流 1~2h,过滤,用水洗至滤液中无铁离子为止 ,置 于 110~120℃烘箱中干燥 ,备用. （9）标准 抗坏血酸标准溶液（ 1mg/ml ）：准确称取 50mg 抗坏血酸 ,用溶液（ 4.1）溶于 50ml 容量瓶中 ,并稀释至刻度 . 抗坏血酸标准使用液（ 100μg/ml）: 取 10ml 抗坏血酸标准液 ,用偏磷酸 -乙酸溶液稀释至 100ml.定容前试 pH 值,如其 pH＞2.2 时,则应用溶液（ 4.3）稀释 . 标准曲线的制备：取下述 标准 溶液（抗坏血酸含量 10μg/ml）0.5,1.0,1.5 和 2.0ml 标准系列 ,取双份分别置 于 10ml 带盖试管中 ,再用水补充至 2.0ml. 5.操作步骤 5.1 样品制备 全部实验过程应避光 . 称取 100g 鲜样,加 100g偏磷酸 -乙酸溶液 ,倒入打碎机内打成匀浆 ,用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度 .如呈红 色,即可用偏磷酸 -乙酸溶液稀释 ,若呈黄色或兰色 ,则用偏磷酸 -乙酸-硫酸溶液稀释 ,使其 pH 为1.2.匀浆的取量 需根据样品中抗坏血酸的含量而定 .当样品液含量在 40~100μg/ml 之间,一般取 20g 匀浆,用偏磷酸 -乙酸溶液 稀释至 100ml,过滤,滤液备用 . 5.2 氧化处理：分别取样品滤液及标准使用液各 100ml 于带盖三角瓶中 ,加 2g 活性炭 ,用力振摇 1min,过滤, 弃去最初数毫升滤液 ,分别收集其余全部滤液 ,即样品氧化液和标准氧化液 ,待测定 . 5.3 各取 5ml 标准氧化液于 2 个 50ml 容量瓶中 ,分别标明 标准及 标准空白 . 5.4 各取 5ml 样品氧化液于 2 个 50ml 容量瓶中 ,分别标明 样品及 样品空白 . 5.5 于标准空白 及样品空白 溶液中各加 5ml 硼酸-乙酸钠溶液 ,混合摇动 15min,用水稀释至 50ml,在 4℃冰 箱中放置 2h,取出备用 . 5.6 于样品 及标准 溶液中各加入 5ml50%乙酸钠溶液 ,用水稀释至 50ml, 备用. 5.7 荧光反应 取标准空白 溶液,样品空白 溶液及（ 5.6）中样品溶液各 2ml,分别置于 10ml 带盖试管中 .在暗室中迅速 向各管中加入 5ml 邻苯二胺 ,振摇混合 ,在室温下反应 35min,用激发光波长 338nm,发射光波长 420nm 测定荧 光强度 .标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标 ,对应的抗坏血酸含量为横坐标 ,绘制标准曲 线或进行相关计算 ,其直线回归方程供计算时使用 . 6. 计