细胞冻存、复苏、传代、转染.pdfVIP

细胞培养系列方法 【实验前准备】 （1）实验前准备好高压的离心管、冻存管、 1ml/100ul 枪头、 PBS溶 液。 （2）清洁超净工作台面，照紫外 30 分钟；同时根据需要将培养基、 胎牛血清、胰酶 PBS液、双抗置于室温下复温。 细胞的冻存与复苏 【实验用品】 （1） 材料：培养的贴壁细胞（ 70%-80%融合）、于液氮中冻存的细胞 （2） 试剂： PBS 液、 %胰蛋白酶液、 DMEM培养基、胎牛血清、二甲 亚砜（ DMSO）、双抗 （3） 设备：培养瓶、巴氏吸管、 15ml 离心管、冻存管、盛酒精的喷 壶、酒精灯、水浴锅、 CO2 培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微 镜、超净工作台。 试剂配制： （1）完全培养基含 90%DMEM培养液加 10%的胎牛血清加 1% 的双抗。 （2）冻存液含 80%的 DMEM培养基加 10%的胎牛血清加 10%的 DMSO，用吸管混匀，置于 4℃冰箱中备用。 细胞的冻存 (1) 依照传代的方法用 %胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进 行消化。 (2) 收集消化细胞于离心管中， 800-1000r/min 离心 5min。 (3) 弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密 6 7 度为 5*10 -1*10 个/ml 。 (4) 每个冻存管分装细胞悬液，旋紧冻存管的盖，并用封口膜密封。 (5) 在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等。 (6) 将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存： 4 ℃, →-20 ℃，1h→-80 ℃， 过夜→转入液氮灌中。 细胞的复苏 （1） 准备水浴锅，调温度至 38℃。打开离心机。 （2） 用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管 1 只，迅速将其置入 38℃ 水浴锅中，不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。 （3） 用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。 （4） 将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中， 加 10 倍体积的 DMEM 培养基，吹打混匀。 （5） 1500r/min 离心 4min，弃上清液。 （6） 加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，对细胞进行计数。 5 （7） 按 5*10 个/ml 的细胞浓度， 将细胞接种在培养瓶中， 置于培养 箱中培养。 （8） 24h 后取出培养瓶，观察细胞生长状况。 【注意事项】 （1） 对数期的细胞增值能力强，冻存后生存率较高，因此，在进行 细胞冻存时，应尽量选择处于此期的细胞加以冻存。 （2） 为了保证复苏后细胞的存活率，复苏接种时，细胞的浓度不能 6 7 太低，最好控制在 5*10 -1*10 个/ml ，这样才能保证复苏成功。 （3） 冻存管的瓶盖应封盖严密，以免复苏时细胞外溢。 （4） 复苏时，从液氮取出冻存管到水浴中融化的过程要快，否则会 导致冰晶的形成，伤害细胞。同时，一次复苏的冻存管数量不 要太多，否则会引起水浴锅中传热不佳，延缓冻存的细胞悬液 融化的时间。 （5） 为防止液氮冻伤，注意戴上防护手套。 【实验结果及分析】 经复苏刚接种的细胞是悬浮于培养基中的。复苏成功的细胞 24h 左右可贴壁