用于微环境粘度检测的荧光寿命成像系统及应用研究.pdf

用于微环境粘度检测的荧光寿命成像系统及应用研究 摘 要 传统荧光显微成像技术主要根据荧光光谱及发光强度等参数的差异实现对 目标物的空间分布定性成像研究；相比之下，荧光寿命显微成像（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM ）可实现目标物的空间分布定量研究，荧光寿 命不受激发光强度、光漂白及探针浓度等因素的影响，仅与探针分子结构及能级 分布有关。荧光寿命反映了荧光探针所处微环境对其发光性能的影响，通过测量 探针分子的荧光寿命，可获得荧光分子所处微环境的定量信息。 荧光寿命的光学测量方法主要包括时域法和频域法，时域法包括基于时间相 关单光子计数（Time-Correlated Single Photon Counting, TCSPC ）的荧光寿命成像、 门控荧光寿命成像技术等，其中时间相关单光子计数法 （TCSPC ）是目前发展最 为成熟、应用也最为广泛的技术。时间相关单光子计数的荧光寿命显微成像技术 （TCSPC-FLIM ）对单光子的探测灵敏度、时间分辨率和信噪比都非常高，在生 物样品微观环境的生化及物理参数的定量表征与测量方面具有很好的应用前景， 可用于生物组织或细胞等样品内包括粘滞度、氧压、温度、离子浓度、环境极性、 酸碱度（pH ）等的定量研究。 在细胞微环境中，微流体的粘度与细胞内物质的运输、重要信号的传导、生 物大分子之间的相互作用以及细胞代谢产物的扩散分解等密切相关，细胞层面粘 度的异常变化往往导致细胞正常功能的紊乱或预示疾病的发生，细胞内环境复杂， 分布不均匀，各细胞器中粘度也各不相同。内质网自噬是细胞内一种高度选择性 的自噬形式，在内质网蛋白质的质量控制过程中起重要作用，蛋白质不折叠或错 误折叠会导致疾病如肿瘤、神经退行性疾病、糖尿病等。内质网中未折叠或错误 折叠蛋白质的大量积累可能会诱发内质网应激反应，细胞通过内质网自噬来缓解 内质网应激反应从而维持其细胞正常生理功能。因此，定量研究内质网自噬的过 程中微粘度变化有助于研究与内质网自噬相关疾病的发病机理。 因此，研制一套同时具备荧光强度与荧光寿命成像的光学显微成像系统将对 实现微环境参数检测提供巨大帮助。本硕士论文采用基于时间相关单光子计数技 术的荧光寿命显微成像技术，搭建了共聚焦荧光寿命显微成像系统 （Confocal-FLIM ），在此基础上研究了双模态微环境检测的可行性、内质网自噬 I 用于微环境粘度检测的荧光寿命成像系统及应用研究 过程中局部微环境粘度变化检测的可行性、准确性。 本论文的主要工作内容如下： 1. 根据激光扫描共聚焦显微成像和时间相关单光子计数技术原理搭建了一 套 Confocal-FLIM 成像系统，并使用铃兰根茎成像实验验证了系统的可 靠性；同时对荧光寿命数据分析方法作了详细的理论介绍。 2. 基于具有双发射峰荧光探针的特性，提出了一种双模态微环境粘度检测 的方法，该方法可通过比例荧光强度与荧光寿命两种模态检测微环境粘 度，两种结果的相互佐证，将进一步提高检测的准确度。 3. 基于自主开发的双功能荧光探针，通过大量探针性质检测实验验证理论 的可行性，溶液测试构建了粘度与寿命之间的指数函数关系式，最后在 Confocal-FLIM 成像系统中成功检测到了基于内质网自噬过程中局部微 环境粘度的变化。 本论文的创新点如下： 1. 根据激光扫描共聚焦显微成像和时间相关单光子计数技术原理搭建了 一套 Confocal-FLIM 成像系统，该系统具有廉价、易拓展升级的特点， 针对系统硬件损坏老化，可随时更新或维修。 2. 提出了一种双模态微环境粘度检测的方法，该方法可通过比例荧光强度 与荧光寿命两种模态检测微环境粘度，两种结果的相互佐证，将进一步 提高检测的准确度。 3. 基于Confocal-FLIM 成像系统成功检测到了基于内质网自噬过程中局部 微环境粘度的变化，该应用可提供一种定量检测活细胞内动态自噬过程 的方法，同时该荧光探针有望成为研究内质网自噬的有用