异丁香酚单加氧酶的定向进化.pdf

异丁香酚单加氧酶的定向进化 摘 要 香草醛香气浓郁，是香料香精中最受欢迎、应用最广泛的品种之一，目前市 场上主要有化学合成香草醛、天然香草醛和生物香草醛，近年来，食品安全和环 境污染等问题层出不穷，化学合成法因过多使用有机溶剂和危险化学试剂、大量 产生废弃物等对环境污染严重，对人体存在着较大的安全隐患；天然香草醛存在 于香荚兰豆中，但仅占2%含量（干重），直接提取成本高，且受种植环境、政府 政策等因素影响大，难以满足市场对天然香草醛的需求，人们越发渴望开发一条 绿色合成路线来工业化生产天然香草醛。2008 年，联合国食品法典委员会在法 规中定义：以天然原料为底物，通过物理过程或酶法或微生物工艺制备的香料可 视为天然香料。异丁香酚是生产香草醛理想的天然原料，异丁香酚单加氧酶是转 化异丁香酚生成香草醛的唯一关键酶，经由能表达该酶的工程菌生产的生物香草 醛几乎等同于天然香草醛，但此转化路线存在瓶颈之一是酶活性较低，转化周期 长。定向进化是一种能改善酶的性能，甚至创造出新酶的技术手段，本课题对异 丁香酚单加氧酶自动诱导表达体系进行了探索，并以课题组前期点突变得到产率 提高76.9%的大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)-pET30a-iem-F281Q （第281 位苯 丙氨酸突变成谷氨酰胺，原始菌株为E.coli BL21(DE3)-pET21a-iem ）的异丁香酚 单加氧酶基因iem-F281Q 为初始基因，通过易错PCR 构建基因随机突变文库， 基于硫代巴比妥酸（TBA ）能与产物香草醛反应和96 孔板大容量的特性建立了 自诱导异丁香酚单加氧酶的96 孔板-TBA 高通量筛选方法，再以高效液相色谱法 （HPLC ）进行复筛。主要研究结果如下： 1) 经SDS分析得知，通过自动诱导表达体系成功表达了异丁香酚单 加氧酶，为建立该酶的自动诱导表达体系，进一步对该酶的自动诱导培养基主要 成分和诱导表达条件进行了优化，最优自动诱导培养基配方为：按胰蛋白胨1.5%、 酵母提取物0.25% 配成母液ZY ；按乳糖5%、甘油25% 、葡萄糖浓度2.0%配成 母液50 ×5052；按原配方配制50 ×M 和1000×微量元素，各取20 mL 50 ×M 和 5052 加到958 mL ZY 中，高压灭菌，再分别加入2 mL 已灭菌的0.75 mol/L 50 × MgSO ·7H O （终浓度为1.5 mmol/L）和0.2 mL 1000 ×微量元素（终浓度为0.2 4 2 倍）；最适诱导表达条件为4%接种量接入装有7.5 mL 培养基的50 mL 锥形瓶中， I 异丁香酚单加氧酶的定向进化 于200 rpm ，30℃诱导表达10 h ，以此异丁香酚单加氧酶转化异丁香酚生产香草 醛可达到2.04 g/L ，比优化前提高了1.5 倍。并通过简化该条件下酶活测定步骤， 优化测试方法，标准偏差从 16%调整到12%，基本满足高通量筛选要求。 2) 探索了基于中间产物活性氧的可见光分光光度法的高通量筛选方法，此 方法操作简便，检测时间短，但剩余的底物异丁香酚会严重影响其吸光值，在本 课题中不宜作为高通量筛选方法。而异丁香酚对基于产物香草醛的可见光分光光 度法影响较小，与高效液相色谱法的检测结果趋势一致，可将此法作为异丁香酚 单加氧酶的筛选方法。 3) 以异丁香酚单加氧酶基因iem-F281Q 为模板，优化了易错PCR 反应体系 中基因诱变因子Mn2+浓度，其最适浓度为0.05 mmol/L，经由易错PCR 构建了阳 性率为80%的基因随机突变文库。 4) 基于上述96 孔板-硫代巴比妥酸的高通量筛选方法对940 株菌进行初筛， 再以HPLC 法测定香草醛含量进行复筛，得到一株突变菌株F10 ，其活性提高至 154%，是改造前原始菌株E.coli BL21(DE3)-pET21a-iem 产物生成率的2.4 倍。 经序列分析，与亲本菌株E.coli BL21(DE3)-pET30a-iem-F281Q （第281 位苯丙氨 酸突变成谷氨酰胺）相比，突变菌株F10 共发生了四处突变，其中一处为无义突 变，第 354 位蛋氨酸（ATG ）被突变成