荧光定量PCR原理及的应用精品.pptVIP

实时荧光定量PCR原理及应用 谢建红 实时荧光定量PCR的基本原理 实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩 增反应中每一个循环产物荧光信号的实时 检测从而实现对起始模板定量及定性的分 在实时费光定量PCR反应中,引入了一种 费光化学物质,随着PCR反应的进行, PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也 等比例增加。每经过一个循环,收集 燙光强度信号,这样我们就可以通过荧光 强度变化监测产物量的变化,从而得到 条荧光扩增曲线图 wWW, comao 光扩增曲线分为三个阶段:荧光背景信 阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。 发光背景信号阶段:为扩增最初的10~15 循环,扩增的荧光信号被荧光背景 所抢盖,我们无法判断产物量的变化。 平台期:扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR的终产物量与起始模板量之间没有线 性关系,所以根据最终的PCR产物量不能 计算出起始DNA拷贝数。 指数期:此期PCR产物量的对数值与起始 模板量之间存在线性关系,因此我们可以 选择在这个阶段进行定量分析。为了定量 和比较的方便,引入了两个非常重要的概 光阈值和CT值 荧光國值:是在荧光扩增曲线上人为设定 的一个值,它可以设定在荧光信 数扩 增阶段任意位置上,但一般我们将荧光域 值的缺省设置是3-15个循环的荧光信 标准偏差的10倍。 CT值:每个反应管内的荧光信号到达设定 的域值时所经历的循环数被称为CT值 值与起始模板的关系研究表明,每个模 板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存 在线性关系,起始拷贝数越多,到达荧光 网值的C值越小,反之越大 wwW 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准 曲线,其中纵坐标代表起始拷贝数的对数 横坐标代表αt值。因此,只要获得未知样 晶的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样 品的起始拷贝数。 定量方法 绝对定量:是用一系列已知浓度的标准 制作标准曲线,在相同的条件下目的基因 测得的荧光信号量同标准曲线进行比较, 从而得到目的基因的量。 Standard Curve +3∞3 01n212减1a切10 rmm mmm loman nn Quantity