利用Faecalibacterium菌16S rDNA基因标记检测环境水体中鸭粪便污染的研究.pdfVIP

重庆大学硕士学位论文 中文摘要 摘 要 随着畜禽食品需求的快速增长，畜禽养殖业也得到了高速发展，然而大规模 养殖造成的动物粪便污染问题不容小觑。粪便中含有大量致病菌和病原体，严重 威胁了生态环境和人类健康。因此，研究出一种能高效精确地检测水体粪便污染 源的技术迫在眉睫，传统的粪便指示菌（如大肠杆菌、肠球菌等）能够在宿主体 外适宜的环境中生存繁殖，难以真正反映水体污染的情况。故本研究根据 Faecalibacterium 菌16S rDNA 基因序列在不同宿主间的宿主序列差异来设计鸭特 异性基因标记物，从而对水体鸭粪便污染进行检测。 本实验共采集了六个常见物种的 246 份粪便样品，分别为人、鸭、鸡、猪、 狗、牛。高通量测序共获得646,587 条有效16S rDNA 序列，并分析个体粪便微生 物多样性。结果显示：丰度最高的分别是厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门，其中 厚壁菌门在不同动物粪便微生物的占比约为 35.45%-68.68% ，拟杆菌门约占 12.86%-47.3% ，变形菌门约占 0.71%-34.41% ；人、鸭、鸡、猪、狗、牛粪便微生 物中香农指数 （Shannon-wiener ）平均数分别为0.9392、1.2174、1.2148、0.8324、 1.1547、1.2293，辛普森指数 （Simpson ）平均数分别为0.5529、0.6321、0.6257、 0.4591、0.5418、0.6422 ，皮卢指数（Pielou ）平均数分别为0.4241、0.3652、0.3893、 0.3397、0.3966、0.4419 。而对不同地区的鸭粪便微生物多样性分析结果为：重庆、 贵州、陕西和四川的鸭粪便微生物香农指数平均数依次为：1.2217、1.2473、1.2151、 1.1869，辛普森指数平均数依次为：0.6431、0.6647、0.6358、0.6032，皮卢指数平 均数依次为：0.3772、0.3863、0.3744、0.3512 。 本研究所设计的两组鸭特异性Faecalibacterium 菌引物（FDu-1 和FDu-2 ）的 特异性均为 100%，阳性率分别为93.75%、90.63%，灵敏度分别为7.95×107 拷贝 9 数/ 100 mL、1.89×10 拷贝数/ 100 mL，由于FDu-1 的阳性率和灵敏度都高于FDu-2 ， 因此确定FDu-1 为最佳引物。 为探究 FDu-1 在水体中的稳定性，实验室模拟了鸭粪便污染水体，选择不同 水质（河水、蒸馏水）、不同温度（10°C、30°C ）、光照条件（光照、黑暗）作 为变量。结果显示：10°C、黑暗条件下，FDu-1 在河水和蒸馏水中的衰变时长分别 为108 h 、132 h ；30°C、黑暗条件下，FDu-1 在河水和蒸馏水中的衰变时长分别为 48 h 、84 h ；河水中、光照条件下，FDu-1 在 10°C 和30°C 衰变时长分别为96 h 、 36 h 。 最后，随机采集了不同地区的实际环境水样对FDu-1 进行实用性检测，鸭粪 便污染水样的检测结果为阳性，非目标粪便污染水样为阴性；另外，距离鸭粪便 I 重庆大学硕士学位论文 中文摘要 采样点距离越远的水样，阳性率越低。 本文设计并验证的鸭特异性Faecalibacterium 菌基因标记物能独立检测、追踪 水体中鸭粪便污染，为水环境中的粪便污染源检测提供了一种新的工具和方法。 关键词：Faecalibacterium ；微生物源示踪；鸭粪便污染；定量PCR ；衰变 II 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 Abstract With the rapid growth