斑点印迹杂交课件.ppt

斑点印迹杂交 掌握斑点印迹杂交的原理及方法 实验目的 ? 杂交 ：具有一定 同源性 的两条 核酸单链 在一定条件下（适宜的温度及 离子强度等）可按 碱基互补原则 形成双链，此杂交过程是高度特异的。 杂交的双方是待测核酸及探针。 ? 斑点杂交 ：是指将待测的 DNA 变形后点加在硝酸纤维素膜（或尼龙膜） 上，用已标记的探针进行杂交，洗膜（除去未结合的探针），放射自 显影，判断是否有杂交或其杂交强度，主要用于基因缺失或拷贝数改 变的检测。根据点样磨具不同，点样形状呈圆形称为斑点杂交，呈狭 缝形则称为狭缝杂交。 实验原理 斑点印迹杂交 不需要电泳和转移，杂交过程包括点样， 变性，中和，干燥固定，预杂交，杂交，封闭，检测杂交 结果等步骤，相对 southern 印迹杂交和 Northern 印记杂交 来说快，适合于同时分析多个样品。 实验步骤 ： 1 变性：按 8:1 将 80ul ddH 2 O 加入至 10ul 待测 DNA 样品中，稀释样品。 100 ℃ 加热 10min 后， 立即 置于冰中 5min （ 使 DNA 变性 ），加入 90ul 20 × SSC 混匀。 ? 点样 ：将上述变性后的样品 180ul 点在尼龙膜的毛面上，真空抽滤， 室温下风干后，于烤箱中 120 ℃ 烘烤 15min 。 使变性的 DNA 与膜结合牢固 1 预杂交：将膜封入 15ml 离心管中，做好剪角标记。加入预杂交液 3ml 。 置 42 ℃ 恒温摇床上，轻轻振摇 30min 。 封闭杂交膜上多余的非特异性 DNA 结 合位点 2 杂交：加入探针 3ml （生物素 -DNA ），置 42 ℃ 恒温床上，轻轻振荡 1- 2h 。 变性 DNA 与探针结合 5 洗膜：倒掉杂交液，洗液 1( 每次 5ml ）洗膜三次（ 洗液 1 预热到 42 ℃ ），每次 5min ；再将洗液 2 ( 每次 5ml ）洗膜两次（ 预热 到 42 ℃ ），每次 15min 。 洗去未结合的探针，否则本底会太高 6 封闭：倒掉洗液 2 ，加入 5ml 封闭液， 37 ℃作用 15min 。 封闭杂交 膜上非特异性的蛋白结合位点 7 酶联抗体结合：倒掉封闭液，加入 3ml 亲和素 - 辣根过氧化物 酶（ HRP ），于 37 ℃轻轻振摇 30min 。 酶联抗体与生物素结合 8 洗膜：倒掉第七步骤中液体，加入 5ml 洗液 3 ，洗膜三次，每次 2-3min 。 洗去未结合的酶联抗体 9 显色：洗膜后，加 3ml 的显色液 避光显色 1-2min ，斑点出来后 就可倒掉显色液，用 ddH 2 0 冲洗几次，终止显色。 斑点杂交预期结果图 ? 制备样品→点样→固定（可用斑点杂交仪 或直接点样） NCF 滤纸 点样板 支撑板 至真空泵 废液储槽 96孔 12×8