全内反射荧光成像基本原理幻灯片.pptVIP

1 全内反射荧光成像基本原理 Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) 2 全内反射荧光显微镜 (TIRFM) 3 目前用于单分子研究的检测技术主要有两大类：扫描 探针显微技术（ SPM ）和光学技术。其中： SPM 原子力显微技术（ AFM ） 扫描离子电导显微技术（ SICM ） 扫描隧道显微技术（ STM ） 光学技术 光学显微镜成像 光学操纵 共聚焦荧光显微技术 （ LSCM ） 扫描近场光学显微技术 （ SNOM ） 全内反射荧光显微技术 （ TIRFM ） 4 上世纪 80 年代， Axelrod 等生物物理学家对 TIRFM 技 术及基本原理进行描述，并探索了其在生物方面的应用。 发展历程 Axelrod,Julius 阿克塞尔罗德（ Axelrod,Julius) 美国 生物化学家及药理学家。 1970 年他与 卡茨冯奥伊勒共享了 诺贝尔生理学和医 学奖 。于美国卫生研究院度过其大部职 业生涯。他研究药物及激素的作用、神 经冲动传播的化学方面，并特别研究松 果体的功能。 5 光反射和折射示意图 6 全内反射示意图 7 n 1 n 2 Refracted TIR n 1 n 2 光的反射和折射 Snell 定律： 8 9 当入射角不断增大，透射角为增大 90 °时，入射角达 到临界角 θc 。依据 Snell 定律得出： 当入射角继续增大时，光不再透射进水溶液，即发 生了全内反射。 90 o n 1 n 2 TIR 10 实际上，由于光的波动效应，有一部分光的能量会透过 临界面渗透到水溶液中，平行于界面向水溶液中传播，这一 部分透过的能量场则称之为 “隐失波” 或“隐失场” 。 隐失波 90 o n 1 n 2 TIR 隐失波 11 隐失波的频率与入射光线的频率相同，其强度随临界 面的垂直距离呈指数衰减： 其中： Z 是离开分界面的距离， I(z) 表示距离界面 Z 处的 强度； I(0) 表示临界面处的强度。 12 由于隐失波仅在界面上 极薄的一层 范围内传播，所以利 用隐失波照明样品，可以仅激发厚度 大约 100nm 内的荧光 团，而更深层溶液中的荧光基团不会被激发，因此极大地提 高了显微成像的对比度和信噪比。 d 12 是渗透深度，它等于从分界面处到光强衰减 l/e 处的 距离。 13 隐失波的渗透深度 d 12 是入 射角及相对折射率的函数。 d 12 是渗透深度 , 它等于从分 界面处到光强衰减到分界面处 数值 l/ e 的处的距离。对于可见 光波长而言，浸透深度约为 100 nm 。 隐失波强度成指数衰减曲线 14 隐失波存在的实验证明 两块光密媒质做的棱镜中间夹一薄层空气层 ( 光疏媒 质 ) 。 如果不断减少空气层的厚度 , 由于空气层中有透射波 , 这透射波进人第二块棱镜。 15 光学隧道效应 光强度并不发生全反射 , 而是有隐失波存于介质 2 中。当 光疏介质薄膜的厚度 小于隐失波的渗透深度 时 , 这个波不仅 穿过了光疏介质 , 而且会促进邻近高折射率介质 3 中的电子 作受迫振动 , 由此产生了新的次波 , 隐失波的形态发生了显 著改变 , 全反射被破坏 , 能量发生了流动 , 导致了光学 隧道效 应 的产生。 16 全内反射荧光显微技术，是利用光发生 全内反射 时产生 的 隐失波 照明样本，仅激发样本表面薄层范围内的荧光基团。 与传统的荧光显微镜相比，使显微成像在 Z 轴上的空间 分辨率 得到了显著改善，大大提高了图像的 信噪比和对比度 。 17 全内反射荧光显微成像系统 18 分子荧光的产生 当一束特定波长的光照射到物质时，物质分子与光量 子发生“碰撞”。如果这次碰撞时有效的： 吸 收 hv 放 热 H 放 热 H** 荧 光 hv S 2 S 0 S 1 19 激发态停留时间短、返回速度快的途径发生的几率大。 荧光： 10 -7 -10 -9 s 磷光： 10 -4 -100s 分子荧光的产生 20 电子跃迁的单重态（单线态）与三重态（三线态） 在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子 （ n, π ）处于不同的自旋状态，通常用多重态 M 来描述： M ＝ 2S ＋ 1 ＝ 1 电子自旋的大小用自旋量子数 S 表示， S 可为 +1/2 或 － 1/2 ，这里的正负号取决于自旋的方向。基态中每个能 级通常被两个自旋相反的即自旋配对的电子占据， M=1 ， 成为单重态。 21 当成对电子中的一个被激发到 S 1 、 S 2 等电子能 级激发态时，其自旋不变，即仍和处于基态的另一 电 子 成 对 。 这 些 能 态 都 被 称 为 单 线 态 或 单 重 态 (singlet state) 。 但如果处于第一电子激发态