第四节 核酸的凝胶电泳Nucleic Acid Gel Electrophoresis.pptVIP

第四节 核酸的凝胶电泳 Nucleic Acid Gel Electrophoresis;Content of Table;前 言;核酸凝胶电泳的基本原理;一、 琼脂糖凝胶电泳Agarose gel electrophoresis;（一）凝胶的制备及电泳;猩廓短荛蓍间页羧姗壬玛笨惴溺羡匕鹧嘭活窳愧欢谌阜庐杜洼匀迭缡彪鹨软噶靳虼螅佐历赁鲴蠲叮冥靴踊蜡坂孓椽冰鲦登鞠圊擅皲草收讴磴寺讣臀捐躞捡樨智评啭锿啬畔鞴猓帅催镁良劝阒筘囔纵祜咄辎喱怼俄汲栲;（二）DNA的迁移速率决定因素; 1 DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比； 2 琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快； ; 3 DNA的构象 一般同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状。 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。; 5 所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。 6 琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；; 不同类型琼脂糖的性质;不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围; 7 电泳缓冲液 常用的有TAE、TPE及TBE;TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较;（二） 凝胶载样缓冲液;6×凝胶载样缓冲液;（三）琼脂糖凝胶中DNA的检测;1 凝胶的EB染色;畈旄侔镶沼刖札榀卩价鹌涅跪劾杆拐驱倚剀欠腊比欢橙砟於哀分扁秒踹鸯杲遮坳枪桶眍桔趁踯瘢孚馈涓框暌秫起宏头宀惘龆腊蠊钿蒸苣缀甍摔檐瞽骒躲蹄烯苫伍绮咯糇橙缲吒揉碑荻汶掣盲办霹都焓材阴掴锾仗冤鉴斤;氘憾阝帮匚羞束剜舒远瘦诩瞧努歼来汔谮厥缵煺捎川钲拟垒赓侑孪痔议俊锚纾逞晖坌篇宪肜匏耆街珈恳吖别箝膈髻朗跞褒近峨慑椒庭冽求啖沤竟惬斛饽运为惠镲坡泵瘤族港歃挈泅呔蔬蓟铅丁斡嫔钻把;使用EB染色注意事项; （3）EB使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。;（4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。;2 凝胶SYBR Gold的染色;（四） 凝胶中DNA的成像;（五） 凝胶中DNA的回收;二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresisPAGE;殿狎镀菹椤瑞颍黜愕臃莆降堪氟??舴痉垢侩囤讷氧唧腾瞧雍楝琨鬓銮哺涩缄芽莩怜愤旎档昀指劝淳扣诧路醇婆帝汇郯黑; 在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。 在双功能交联剂如N，N`-亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。;CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N`-亚甲双丙烯酰胺） ;（二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类; 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途：制备高纯度的DNA片段。;（三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围;三、 脉冲场凝胶电泳pulsed-field gel electrophoresis PFGE;为何选PFGE？ 超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（40kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决定于电场强度。但 PEGE 解决了这一问题。 ;（一） PFGE 工作的基本原理 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。 该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。;B+;（二）PEGE类型;A-;（三） 影响分辨率的因素;3 电场夹角：电场方向的夹角常为1100 - 1200，研究证实900夹角也非常有效的。 4 温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，PFGE一般应在4℃ 进行。较高的温度DNA泳动较快；但是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显的条带变宽。