(完整版)硫酸铵分级沉淀原理及实验方案.docVIP

一， 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免 疫球从样品中分离， 是免疫球蛋白分离的常用方法。 高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。 各种蛋白质的溶解度不同， 因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。 这种方法称之为盐析。 盐浓度通常用饱和度来表示。 硫酸铵因其溶解度大， 温度系数小和不易使蛋白变性而应用最为广范。 二， 试剂及仪器 1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等 硫酸铵（ NH 4 ） SO 4 饱和硫酸铵溶液（ SAS ） 蒸馏水 PBS( 含 0.2g /L 叠氮钠 ) 透析袋 超速离心机 pH 计 磁力搅拌器三， 操作步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。 各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸 铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50% 。 （一）配制饱和硫酸铵溶液（ SAS ） 1.将 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 边搅拌边慢慢加到 1 升 蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸 pH7.0 。此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液（ 4.1 mol/L, 25 ° C ） . 2.其它不同饱和度铵溶液的配制 （二）沉淀 1.样品（如腹水） 20 000 ′ g 离心 30 min ，除去细胞碎片； 2.保留上清液并测量体积； 3.边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液中，终浓度为 1 ： 1 （ 4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 （三）透析 6 小时或搅拌过夜（ 4 ° C ），使蛋白质充分沉淀。 蛋白质溶液 10 000 ′ g 离心 30 min （ 4 ° C ）。弃上清保留沉淀； 将沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS-0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 PBS-0.2g /L 叠氮钠透析 24-48 小时（ 4 ° C ）， 每隔 3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨； 透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。四，应用提示 （一） 先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。 边搅拌边慢慢加 SAS 到样品溶液中，使浓度为 0.5:1 (v/v) ； 将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时 或过夜（ 4 ° C ）； 3.3000 ′ g 离心 30 min （ 4 ° C ），保留上清液；上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨； 上清液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨； 杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效 （二） 为避免体积过大， 可用固体硫酸氨进行盐析 （硫酸氨用量参考表 1 ）；硫酸氨沉淀法与层析 技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。 今天作的实验是利用硫酸铵沉淀蛋白质，从之前作过的经验知道，这一个步骤是有名的烦， 要慢慢用敲的把硫酸铵缓缓的加入蛋白质溶液中。 相关的原理可以在庄荣辉学习网站中找到，与盐溶刚好相反，在蛋白质溶液中加入硫酸铵， 会使得蛋白质的溶解度下降， 因而沉淀出来。 因为硫酸铵所解离的离子容很大， 所带的电子数也多 (NH4+, SO42-)，因此当其溶入水中时，会吸引大量水分子与这些离子水合。 蛋白质分子表面多少有一些较不具极性的区域，水分子会在这些非极性区的表面聚集，形 成类似『水笼』的构造 (请见下图 )，以便把蛋白质溶入水中。一旦蛋白质溶液加入硫酸铵， 后者吸引了大量水分子， 使水笼无法有效隔离蛋白质的非极性区， 造成这些非极性区之间的吸引， 因而沉淀下来。因此，分子表面上若有越多的非极性区域， 就越容易用硫酸铵沉淀下来。 在计算所添加的硫酸铵的重量方面，找到了一个不错的网站——硫酸铵计算机 这个网页上可以靠着输入实验温度、 溶液体积、 想要到达的百分浓度以及初始的百分浓度这 四个数值， 就可以得到需要添加的硫酸铵克数， 以及在加入固体硫酸铵后所增加的体积， 算是一个很不错的网站。 此外另一个比较值得提的， 是我有用两种方式加入硫酸铵， 第一种是固体的硫酸铵模碎加入， 另一种是将硫酸铵溶成饱和溶液再加入，各有各的优缺点，比较如下： 1.造成蛋白质变质的程度：固体的硫酸铵 硫酸铵饱和溶液 利用硫酸铵饱和溶液真的超棒，滴入的速度可以很快而不造成变质 (没试过用倒入的 ) 。 不像固体的硫酸铵只能磨碎慢慢加入，速度一快蛋白质就坏了 (溶液有致密的白色气泡产生 )。2.操作的容易度： 硫酸铵饱和溶液 固体的硫酸铵 固体硫酸铵最大的缺点就