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柱层析培训 Sundia Xie Lihua 2012  柱层析的原理 硅胶层析法的分离原理是根据物质在 硅胶上的吸附力不同而得到分离, 般悄况下极性较大的物质易被硅胶吸 附,极性较弱的物质不易被硅胶吸附, 整个层析过程即是吸附、解吸、再吸 附、再解吸过程。  主要步骤 、估算和称量硅胶 、选柱子, 三、装柱 四、上样。 五、过柱和收集。 六、检测。 七、样品最后处理。  估算和称量硅胶。 ·200一300目硅胶,称1530倍上样量;这个比例不是 绝对的,如果是很好分的样品,比例可以更低,如果是很 难分的样品,比例还可以更高,如果极难分,也可以用 50倍量硅胶H。但超出50就没有太大意义了。干硅胶的视 密度在0.4左右,所以要称40g硅胶,用烧杯量100ml 也可以。  选柱子。 柱子的大小是根据硅胶的用量决定的,硅胶的用量又是由 样品的性质和数量决定的,其次就是柱子应该装多高,通 常柱子的高度是根据它的直径来决定的,大约柱高:柱直 径的比例是1:-1:10,这个比例也不是绝对的,好分的 样品可以用短粗的柱子,高/径比例就低,难分的要用细 长的柱子,高/径比例就高些,但也不是越高越好,太高 了,过柱时间太长,无序扩散厉害,反而分离效率低。有 了以上的两条,基本上就可以算出来要选用什么尺寸的柱  装柱。有干法装柱和湿法装柱两种 湿法装柱 先要把干硅胶搅成匀浆,具体做法是加入干硅胶体积一到两倍的溶剂用玻璃棒充分搅 拌,如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系,就用石油瞇:如果洗脱剂是仿 醇体系,就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆,说明溶剂太少或者其中含水量太大,尤其 是用乙酸乙酯/丙酮,如果不与水配伍走分配色谱的话,必须预先用无水硫酸钠久置 干燥。氯仿用无水氯化钙干燥,以除去1%醇。如果样品对酸敏感,不能用氯仿体系 过柱 然后如果是小柱子装上蓄液球,打开柱下活塞,保持柱子通畅,把硅胶与低极性溶剂 混合的悬浊液(硅胶溶剂比约1:1~2)倒入柱子将匀浆一次倾入蓄液球內。然后轻轻敲 打柱身使混入的气泡自然排出。然后随着沉降,会有些硅胶沾在蓄液球内.最后用石 油醚(氯仿)将其冲入柱中。如果柱子比较大,敲打柱身一般是排不出气泡的,还需 要用干净的搅棒,轻轻朝一个方向慢慢搅动,以利于气泡的排出。如此反复几次,再 用装柱溶剂把柱子压实(约2倍柱体积溶剂),在保持10cm以上的溶剂高度下,慢慢 加入石英砂,再把液面压到与石英砂平齐,柱子就装好了。 意悬浊液既不能太稠也不能太稀,太稠会影响流动性,气泡不容易赶出,导致柱身 有空洞,太稀了太花时间,影响工作效率。  装柱。有干法装柱和湿法装柱两种 干法和湿法装柱的共同注意事项及优缺点比较 鉴于硅胶是弱酸性的,如果过柱样品对酸敏感或者本身是碱性的,一般在装柱溶剂中 添加2-5%的三乙胺,可以改善敏感和拖尾。 如果是加压,一定记住先泄压,再关柱子的阀门,否则柱填料可能会被顶空,如果是 真空负压,则一定是先关阀门,然后再泄真空,否则也是会被顶空。总而言之,时时 刻刻都要保持柱子的下端压力一定不能超过上端 干法优缺点 这种方法的好处是速度快,柱子装的非常紧密,柱效相对较高 不好的地方是,操作较苛刻,柱子的下阀门一定不能漏 有时候柱子过于密实,影响洗脱流速 湿法优缺点:操作相对简便,但费时费事费溶剂,硅胶容易扬尘。  四、上样。有干法上样和湿法上样两种 干法上样: 就是把样品溶解后加入粗硅胶,然后除去溶剂,先把样品制砂。要点有以下 几点,样品一定要全溶,不能用细硅胶,制砂一定要干燥彻底。特别是溶样 溶剂如果是大极性时,更要干燥彻底。否则,会影响洗脱时的实际洗脱比例, 导致分离效率过低。样品:粗硅胶:溶剂的大概比例为1:1~2:2左右,具体 比例还要根据样品的溶解性和粘稠性确定。难溶、粘稠的样品,硅胶和溶剂 的比例就越高。硅胶过少会让粘稠难溶的样品粘结成团,无法均匀分散,洗 脱的时侯,洗脱剂只会冲洗到团块的表面,而洗不到团块的内部。导致拖尾 严重和回收率损失。硅胶过多则造成浪费,同时也会造成拖尾