基因突变的检测方法[参考].pdfVIP

基因突变的检测方法 基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞 癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985 以前，利用Southern 印迹法， 可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只 能应用复杂费时的 DNA 序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展， 目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR 的基础之上，并且由PCR 衍 生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短， 分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。 下面分别介绍几种 PCR 衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择 时参考。 PCR-SSCP 法 PCR-SSCP 法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA 和 RNA 分子依其大 街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速 度改变。其基本原理为单链 DNA 在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱 基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简 单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用 PCR-SSCP 法检测小于 200bp 的PCR 产物 时，突变检出率可达 70％-95％，片段大于400bp 时，检出率仅为 50％左右，该法可能会 存在 1％的假阳性率。应用PCR-SSCP 法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵 敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar 等认为对于大于 200bp 的片段，用其RNA 分子来做 SSCP 会提高其录敏度。应用 PCR-SSCP 检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、 肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因 p53 突变最 常用的方法，仅检测第 5-8 外显子即可发现 85％以上的p53 基因突变。由于该法简便快速， 特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA 法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型 DNA 双链。由 于突变和野生型 DNA 形成的异源杂合双链 DNA 在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中 电泳时，会产生与相应的同源双DNA 不同的迁移率。该法与 SSCP 相似，所不同的是 SSCP 分离的是单链 DNA，HA 法分离的是双链 DNA，也只适合于小片段的分析。但HA 对一些不能 用 SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近 100％。 突变体富集 PCR 法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras 基因家族某个密码 子部位存在已知的限制性内切酶位点，如 K-ras 基因第 12 密码子的 BstNI 位点，第 13 密 古巴子有 Bg ⅠⅡ位点。用链续二次的巢式 PCR 来扩增包括 K-ras 第 12、13 密码子的 DNA 片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的 DNA 片段，野生型因被酶切而不能 进入第二次 PCR 扩增，而突变型则能完整进入第二次 PCR 扩增并得到产物的富集。 变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE 法分析 PCR 产物，如果突变发生在最先解链的 DNA 区域，检出率可达 100％，检测片段可达 1kb，最适 围为 100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA 在变性梯度凝胶中进行到与 DNA 变性湿度一 致的凝胶位置时，DNA 发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的 DNA 链中有一个碱基改 变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程 而被分离。由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合 成的 PCR 引物最好在 5`末端加一段 40bp-50bp 的GC 夹，以利于检测发生于高熔点区的突 变。在 DGGE 的基础上，又发展了用湿度梯度代替化学变性剂的TGGE 法（温度梯度凝胶电 泳 temperature gradient gelelectrophoresis,TG