蛋白质测定方法之双缩脲法(Biuret法)[借鉴].pdfVIP

一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产 物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4 形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰 胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲 反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可 用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、 Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点 是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1.试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成 10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA 浓度1mg/ml 的A280 为0.66 来校正其纯度。如有需 要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯 度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl 配制，酪蛋白用 0 ．05N NaOH 配制。 （2 ）双缩脲试剂：称以1.50 克硫酸铜（CuSO4 •5H2O ）和6.0 克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O6•4H2O ），用500 毫升水溶解，在搅拌下加入300 毫升10% NaOH 溶液，用水 稀释到1 升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中 有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2.器材： 可见光分光光度计、大试管15 支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1.标准曲线的测定：取12 支试管分两组，分别加入0 ，0.2 ，0.4 ，0.6 ，0.8 ，1.0 毫升的标 准蛋白质溶液，用水补足到1 毫升，然后加入4 毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温 （20~25℃）下放置30 分钟，于540nm 处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管 作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘 制标准曲线。 2、样品的测定：取2~3 个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样 品浓度不要超过10mg/ml。 三、Folin—酚试剂法（Lowry 法） （一）实验原理 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂 乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原 理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从 而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋 白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的 酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色 深度与蛋白的量成正比。 Folin—酚试剂法最早由Lowry 确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得 到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长， 要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。 对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry 反应。而且对后者的影响还要大得多。 酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris 缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的 尿素（0.5% ），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5% ），乙醇（5% ），乙醚（5% ）， 丙酮（0.5% ）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的 溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅， 则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2 倍。 进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH 条件下稳定，但上 述还原反应只在pH=10 的情况下发生，故当Folin 一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中 时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达5mg 。通常测定范围是20~250mg 。 （二）试剂与器材 1.试剂 （1）试剂甲： （A ）10 克Na2CO3，2 克NaOH 和0.25