动物微生物与免疫技术 动物微生物与免疫技术、任务三 沉淀试验 技能点9沉淀试验.ppt

技能点9 沉淀试验 技能点9 沉淀试验 主要内容 一、目的要求 二、仪器及材料 三、方法与步骤 一、目的要求 掌握炭疽环状沉淀试验和琼脂扩散试验的操作和判定标准。明确此试验在生产中的应用。 二、仪器材料 沉淀试验用小试管、毛细吸管、漏斗、滤纸、乳钵、剪刀、微量加样器(带滴头)、琼脂平板、琼脂打孔器。生理盐水、0.5%石炭酸生理盐水、炭疽沉淀素血清、炭疽标准抗原、疑似被检材料（脾、皮张等）、禽流感琼脂扩散抗原、禽流感标准阳性血清、被检血清、pH7.2、0.01mol/LPBS。 三、方法与步骤 1．环装沉淀试验 （1）被检抗原的制备 热浸出法 取疑似病料（各种实质脏器）1～2g，在乳钵内剪碎、研磨，然后加入5～10ml生理盐水，混合后移至大试管中，煮沸30min，冷却后用滤纸过滤，透明的滤液即为被检抗原。 1．环装沉淀试验 （1）被检抗原的制备 冷浸出法 待检皮张置37℃温箱烘干，高压蒸汽灭菌，剪成小块称重，然后加入5～10倍的0.5%石炭酸生理盐水，在室温或4℃冰箱下浸泡18～24h，滤纸过滤2～3次，使之成为透明液体即为被检抗原。 1．环装沉淀试验 （2）操作方法 取沉淀试验用小试管3支，用毛细吸管吸取炭疽沉淀素血清，分别加入小试管中，每管约至试管1/3处。 取另1支毛细吸管吸取被检抗原，沿管壁轻轻重叠于其中一管的沉淀素血清上面，静置。其余2支试管作对照，分别加入炭疽标准抗原和生理盐水，作对照。 1．环装沉淀试验 （3）结果判定 抗原加入后，5～10min内判定结果。如在小试管重叠的两液界面出现白色沉淀环，为阳性反应。加炭疽标准抗原管应出现白色沉淀环，为阳性对照，而加生理盐水管应无沉淀环出现，为阴性对照。。 此法可用于诊断牛、羊、马的炭疽病，但不能用于诊断猪炭疽病，因猪患炭疽时，用此法诊断常为阴性。 2.琼脂扩散试验 以禽流感琼脂扩散试验为例(选自GB/T18936—2003略有改动) （1）琼脂板的制备 称取琼脂糖1.0g，加到100 m1 pH 7.2、0.01mol/L PBS中，在水浴中煮沸或用电炉煮沸充分融化，加入8g氯化钠，充分溶解后加1％硫柳汞溶液1m1。冷至45℃～55℃时，将洁净干热灭菌直径为90mm的平皿置于平台上，每个平皿加入18～20ml，加盖待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸发，放普通冰箱（4℃）中保存备用（保存时间不超过2周）。 （2）操作 打孔 在制好的琼脂板上按7孔一组的梅花形打孔(中间1孔，周围6孔)，孔径5mm，孔距2～5mm，将孔内的琼脂用注射针头斜面向上从右侧边缘插入，轻轻向左侧方向将琼脂挑出，勿伤边缘或使琼脂层脱离皿底。 （2）操作 封底 用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂板底部刚刚要溶化（手背感觉微烫手）为止，封闭孔底部，以防侧漏。 （2）操作 加样 用微量移液器或带有6～7号针头的0.25ml注射器，吸取抗原悬液滴入中间孔，标准阳性血清分别计入外周的1和4孔，被检血清按编号顺序分别加入另外4个外孔。每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个滴头。 （2）操作 反应（扩散） 加样完毕后，静置5～10min，然后将平皿轻轻倒置放入湿盒内，37℃温箱中作用，分别在24h、48h、72h观察并记录结果。 2.琼脂扩散试验 （3）结果判定 判定方法 将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，若标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，则试验成立。 判定标准 若被检血清孔与中心抗原孔之间出现清晰致密的沉淀线，且该线与抗原和标准阳性血清之间沉淀线的末端相吻合，则被检血清判为阳性。若被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，且标准血清沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性。 传染性法氏囊抗原、抗体特异性结合出现的沉淀线 白色沉淀线 技能点9 沉淀试验